檢測蔬菜水果中甲氰菊酯殘留試紙卡的研制

◎ 扶 勝，羅維超，楊 梅，周 艷

（貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州 貴陽 550009）

甲氰菊酯是一種擬除蟲菊酯類殺蟲殺螨劑，具有使用濃度低、安全間隔期短、對人畜低毒性、對環境較為友好的特點[1]。甲氰菊酯屬于神經毒劑，使昆蟲過度興奮、麻痹而死亡。該藥能快速滅殺多種害蟲，效果持續時間長。對害蟲和葉螨同時具有良好的防治效果，非常適合在害蟲、害螨并發時使用[2]。

由于長期不科學的使用，農產品中甲氰菊酯超標現象時有發生，對生態環境的安全以及農產品的品質造成了很大的影響。近年來，菊酯類農藥對哺乳動物存在很大的毒副作用[3]，人如果長期食用殘留有菊酯類農藥的食物就會造成亞慢性中毒或者慢性中毒。因此，研制一種快速檢測甲氰菊酯殘留的方法對保障人民身體健康以及維護生態環境是十分必要的。

限于目前的檢測條件，對生態環境中甲氰菊酯殘留的了解情況并不樂觀，而所能達到檢測目的所用的檢測的條件也較為苛刻。目前，國內甲氰菊酯殘留檢測的標準分析方法主要有色譜法、免疫分析法和薄層層析法[4]，這些方法對操作分析的人員、各種實驗的條件以及實驗原料試劑和實驗過程要求非常高，它的意義只是存在于實驗室少量的研究，而無法滿足現場的快速檢測的需要。對此也有一些關于膠體金試紙條法的報道，本研究在傳統膠體金法的基礎上，引入金標技術，使樣本中藥物與金標抗體反應，以期提高檢測靈敏度，建立快速、簡便、靈敏的檢測方法，對食品中甲氰菊酯殘留的快速檢測有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氰菊酯：成都思天德生物科技有限公司；抗體、抗原：貴州勤邦食品安全科學技術有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：西安熱默爾生物科技有限公司；甲醇：天津富宇化工；氯金酸（HAu Cl4·4H2O）：百靈威科技有限公司；碳酸鉀：艾科試劑；檸檬酸三鈉、NaCl：成都麥卡希化工有限公司；玻璃纖維、硝酸纖維素膜（NC膜）、樣品墊、PVC底板、吸水墊：上海金標生物科技有限公司。CT 300數控切條機：惠州市惠勝精密工業有限公司；XYZ 3000點膜儀：上海金標生物科技有限公司；JEM-1230透射電子顯微鏡：深圳市盛光儀器有限公司；CHK-2561B 紫外可見分光光度計：濟南鑫貝西生物技術有限公司；TGL-20b R高速冷凍離心機：上海高致精密儀器有限公司；SH-4C磁力攪拌器：鞏義予華儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金的制備及其品質測定

在錐形瓶中，用雙蒸水將質量分數為1.2%的氯金酸溶液稀釋至0.03%，取100 mL，在沸騰；持續高溫、持續攪拌條件下和3 mL 0.5%的檸檬酸三鈉溶液制備膠體金，觀察溶液顏色變為酒紅色時，繼續煮沸15 min后停止加熱，冷卻至室溫，用雙蒸水定容至100 mL，4 ℃保存。通過電鏡觀察和紫外掃描，測量其粒徑大小和最大吸收波長。

1.2.2 膠體金標記抗體的制備

在100 mL錐形瓶中加入30 mL膠體金溶液，在攪拌條件下，用濃度為0.4 mol/L的K2CO3溶液調節pH值至8.0，緩慢加入150～300μg抗甲氰菊酯單克隆抗體，攪拌5 min，室溫靜置45 min；加入質量分數為15%的牛血清白蛋白溶液至終質量分數為1%，靜置30 min。4 ℃、13 000 r/min離心35 min，棄去上清液，復溶液重懸沉淀，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 檢測線與質控線的制作

用包被液將甲氰菊酯抗原與羊抗鼠抗抗體分別進行10倍和60倍稀釋，然后用劃膜儀按1.2μL/cm量劃線，37 ℃烘箱中放置2.5 h，備用。

1.2.3 膠體金免疫層析快速檢測試紙條的組裝

先用質量分數為0.4%的BSA、0.04 mol/L的PBS（pH7.2）將樣品墊浸泡40 s，37 ℃干燥4.5 h。用噴膜儀按5.5μL/cm在玻璃纖維上噴金標抗體，在37 ℃條件下干燥3 h。將甲氰菊酯的包被抗原用0.03 mol/L的PBS（pH7.4）稀釋至0.6 mg/mL，再用噴膜儀按2.2 μL/cm噴到NC膜上，即為檢測線；在檢測線上距離開始端5 mm處按照噴量為2.2 μL/cm噴涂羊抗鼠抗體IgG（0.4 mg/mL），即為質控線，37 ℃干燥條件下2.5 h。將NC膜、玻璃纖維、樣品墊和吸水墊依次組裝在底板上，切割成4 mm寬的試紙條并裝入塑料卡殼中，即為檢測卡。

1.2.4 檢測方法

將檢測卡平放在桌面上，取待檢樣品50μL緩慢加入檢測卡加樣孔中，液體開始流動時計時，8 min后觀察結果。如果檢測線上出現紅色條帶，說明樣品呈陰性；如果檢測線上未出現紅色條帶，說明樣品呈陽性；質控線應始終為紅色，無質控線說明試紙條失效。

1.2.5 檢測限實驗

取經檢驗合格的白菜、蘋果，勻質以后各分成8份，每份（2.0±0.05）g，加入甲氰菊酯標準品，使各份白菜、蘋果中甲氰菊酯的終質量濃度分別為0、0.5、1、2、4、8、16 μg/kg和32 μg/kg，加入8 mL樣本提取液，渦旋儀渦動5 min；4 000 r/min室溫離心5 min；取70 μL上清液用檢測卡檢測，每個濃度樣品重復3次，判斷試紙條的檢測限。

1.2.6 特異性實驗

以0.025 mol/L的PBS（pH7.2）為稀釋劑，分別配制溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和甲氰菊酯標準品溶液，質量濃度分別為0、1、3、5.0、10.0、20.0 μg/kg和50.0 μg/kg，用檢測卡檢測，每個濃度重復3次，根據檢測結果判斷試紙條的特異性。

1.2.7 重復性實驗

取3批試紙條分別檢測白菜、蘋果空白樣品和質量濃度為1 μg/kg的陽性樣品，每個樣品重復5次，判斷試紙條的重復性。

1.2.8 穩定性實驗

將一定量的檢測卡分成3份，分別和干燥劑一起用鋁箔袋密閉包裝，存放于4、25和30 ℃，每隔1個月取出適量，分別檢測白菜、蘋果空白樣品和質量濃度為1 μg/kg的陽性樣品，每個樣品重復5次，判斷試紙條的穩定性。

1.2.9 方法對比實驗

樣品檢測取不同產地的白菜、蘋果樣品各7份，每份（2.0±0.05）g，加入8 mL樣本提取液，渦旋儀渦動5 min；4 000 r/min室溫離心5 min；取70 μL上清液用檢測卡檢測，每個樣品重復5次。同時按GB/T 23502-2009和GB/T 19539-2004和儀器檢測方法的結果進行對比。

2 結果與分析

2.1 膠體金的質量分析結果

用紫外可見光分光光度計在400～600 nm波長范圍內進行掃描，以雙蒸水為空白作對照，測定吸收曲線和吸收峰。結果在波長526 nm處有最大吸收峰，為膠體金的特征吸收峰，如圖1所示。膠體金溶液經透射電鏡觀察結果顯示，所制備的膠體金粒徑均勻。

圖1 膠體金紫外可見光分光光度計掃描圖

2.2 試紙條的檢測限

對已知空白樣品檢測時，檢測線和質控線顏色深淺幾乎相差不大；當甲氰菊酯濃度增加，檢測線逐漸減弱，當白菜、蘋果中甲氰菊酯濃度增加至1 μg/kg時，檢測線較質控線明顯減弱；繼續增加至10.0 μg/kg和20 μg/kg時，檢測線都消失；質控線均出現較深的紅色條帶。由此可見，該試紙條對蔬菜水果中白菜、蘋果的檢測限為1μg/kg。國家標注規定甲氰菊酯在農產品中最大限留量為1 mg/kg[5]。

表1 甲氰菊酯快速檢測試紙條的檢測限表

2.3 試紙條的特異性

由表2可知，甲氰菊酯快速檢測試紙條在檢測中與其他菊酯無交叉反應，只針對甲氰菊酯有特異結合。

表2 甲氰菊酯快速檢測試紙條的特異性表

2.4 試紙條的重復性和穩定性

經驗證，甲氰菊酯快速檢測試紙條的批內和批間重復性為100%，假陽性率和假陰性率均為0%。試紙條在4、25、30 ℃的條件下可保存到第12個月，檢測空白樣品時質控線和檢測線的顯色仍很清晰，檢測白菜、蘋果質量濃度1 μg/kg時，質控線與檢測線比色較明顯；最后確定試紙條密封干燥下，在4～30 ℃的條件下可保存12個月。

2.5 樣品檢測

通過用試紙條測試18份樣品，有1份蘋果和2份白菜結果顯示陽性，其他樣品檢測結果均為陰性。用儀器方法檢測18份樣品，檢測結果顯示也僅有上述3份樣品中甲氰菊酯高于陽性判定線，表明2種方法結 果一致，結果見表3。

表3 GlCA與HPLC和LC-MS/MS檢測樣品中甲氰菊酯結果的比較表

3 結論

本文采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，通過透射電鏡和紫外掃描觀察其顆粒大小以保證膠體金的質量，該方法制備的膠體金大小均一，平均直徑為20 nm左右。以該膠體金標記甲氰菊酯的單克隆抗體，建立膠體金免疫層析法，對該方法進行優化。實驗表明本方法對白菜、蘋果等樣品檢測限為1 μg/kg，批內和批間重復性為100%，假陽性率和假陰性率均為0，從樣本前處理到檢測，整個分析流程耗時不到15 min，大大縮短了單個樣品的檢測時間。與其他方法相比，本法具有快速、簡便、靈敏度高、經濟適用，樣品前處理步驟簡單的特點，大大提高了檢測效率，十分適合現場大批量樣品的現場快速檢測。

[1]無錫端.我國茶葉產業發展現狀與廣東茶葉的未來展望[J].廣東茶葉，2011（3）：3-4.

[2]張荷麗，舒友琴.茶葉中農藥多殘留檢測方法概述[J].湖北農業科學，2010，49（2）：476-478.

[3]桌黎陽.茶葉中農藥殘留分析方法概況[J].中國衛生工程學，2009（2）：36-39.

[4]胡春容，李 君. 擬除蟲菊酯農藥的毒性研究進展[J].毒理學雜志，2005，19（3）：239-241.

[5]國家衛生和計劃生育委員會，中華人民共和國農業部，國家食品藥品監督管理總局.GB2763-2016食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量[S].北京：中國標準出版社，2017.