山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

許 晴，林 森,，朱江江，王 永,，林亞秋*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)是影響肉質(zhì)嫩度和風(fēng)味的重要因素[1]，是肉用畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。IMF沉積受多種因素調(diào)控，其中主要是由脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加和體積的增大造成的。因此，為了闡明山羊肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)理，需以體外培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)手段來(lái)構(gòu)建其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了確保研究的準(zhǔn)確性，必須選擇可靠有效的內(nèi)參基因校正，才能得到真實(shí)可靠的目標(biāo)基因表達(dá)變化情況。研究表明，同一內(nèi)參基因在不同物種[2]、不同細(xì)胞[3-4]、同一物種不同組織[5]以及不同試驗(yàn)處理[6]等條件下其表達(dá)穩(wěn)定性不同，所以內(nèi)參不合適會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析時(shí)結(jié)果出現(xiàn)差異，對(duì)有效內(nèi)參基因的篩選是保證科學(xué)研究準(zhǔn)確性的重要前提。

目前雖然在反芻動(dòng)物上關(guān)于內(nèi)參基因篩選的研究報(bào)道較多，但尚未見在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的內(nèi)參基因的篩選報(bào)道，而且已有的報(bào)道都多集中于不同組織、不同發(fā)育階段和不同病理狀態(tài)下。比如，陳利等[5]指出，在山羊同一時(shí)期不同組織中次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1，HPRT1)表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定，且最佳內(nèi)參組合為HPRT1和RNA聚合酶2(RNA polymerase Ⅱ，RP2)，在不同發(fā)育時(shí)期的骨骼肌中酪氨酸3-單氧化酶(Tyrosine 3-monooxygenase，YWHAZ)表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定，其次是β-肌動(dòng)蛋白(Beta-actin，ACTIN)；Y.Zhang等[7]指出，TATA盒結(jié)合蛋白(TATA box-binding protein，TBP)在山羊肝中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，而在肌肉中表達(dá)較穩(wěn)定基因則為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)；張曉東[8]指出，波爾山羊各個(gè)組織相對(duì)最優(yōu)內(nèi)參基因是18S核糖體RNA(18S ribosome RNA，18SrRNA)，為更精確校正試驗(yàn)數(shù)據(jù)可選擇18SrRNA和TBP二者；W.R.Vorachek等[9]發(fā)現(xiàn)，GADPH和YWHAZ是適合患腐蹄病綿羊中性粒細(xì)胞相對(duì)最好的一對(duì)內(nèi)參基因，但健康綿羊中性粒細(xì)胞最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)殓晁崦摎涿竵喕鵄(Succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)；而在湖羊小腸黏膜的內(nèi)參基因篩選試驗(yàn)中卻表明，被普遍使用的內(nèi)參基因GAPDH和18S不適合，ACTB和磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglycerate kinase 1，PGK1)為該研究的最佳選擇[10]；M. Jedrzejczak等[11]發(fā)現(xiàn)，在牛乳腺上皮細(xì)胞中泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子(Ubiquitously expressed transcript，UXT)和GAPDH展現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性；在熱應(yīng)激和激素處理下，UXT、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase，HPRT)和核糖體蛋白S23(Ribosomal protein S23，RPS23)是牛黑素細(xì)胞較穩(wěn)定的內(nèi)參基因[12]。基于上述報(bào)道發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因穩(wěn)定性具有品種、組織和細(xì)胞等特異性，推測(cè)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化具有自己特異穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

因此，本研究以簡(jiǎn)州大耳山羊體外培養(yǎng)的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，利用qPCR分別檢測(cè)誘導(dǎo)分化0、1、2、3、5和6 d的細(xì)胞中GAPDH、肽酰脯氨基順?lè)串悩?gòu)酶A(Peptidylproyl isomerase A，PPIA)、18SrRNA、肽酰脯氨基順?lè)串悩?gòu)酶B(Peptidylproyl isomerase B，PPIB)、UXT、核糖體磷蛋白大亞基P0(Pibosomal protein lateral stalk subunit P0，RPLP0)、ACTB、真核翻譯起始因子3K(Eukaryotic translation initiation factor 3K，EIF3K)和TBP候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平[2,7,9,13]，然后分別采用geNorm、NormFinder和 BestKeeper程序進(jìn)行分析，綜合比較3種程序分析結(jié)果，并對(duì)Krupple樣轉(zhuǎn)錄因子3(Krupple-like factor，KLF3)和Krupple樣轉(zhuǎn)錄因子12(Krupple-like factor，KLF12)的表達(dá)水平進(jìn)行校正分析，進(jìn)而確定在山羊前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中最優(yōu)內(nèi)參基因及最優(yōu)內(nèi)參基因組合，為山羊肌內(nèi)脂肪沉積分子機(jī)理的研究提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的獲得及誘導(dǎo)分化 本試驗(yàn)所用原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為前期試驗(yàn)分離和純化[14]，置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｈ〕龅蜏乇４娴脑?nèi)脂肪細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)，傳至F3代時(shí)加入誘導(dǎo)分化液(100 μmol·L-1油酸)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并分別在第0、1、2、3、5和6 天收集細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑 培養(yǎng)基(DMEM/F12)和胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gemini公司；油酸購(gòu)自Sigma公司；TRIzol和SYBR?Premix ExTaqTM (2×)購(gòu)自TaKaRa公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA的合成 按照TRIzol試劑盒的使用說(shuō)明提取F3代山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量、濃度以及A260 nm/A280 nm值(該值為1.9～2.1的RNA樣品才可用于后續(xù)試驗(yàn))。使用Thermo公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取以1 μg總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 本研究選取GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank上9個(gè)基因在山羊中的序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。將cDNA模板按5倍進(jìn)行稀釋，選取5-1～5-4稀釋倍數(shù)樣品進(jìn)行qPCR，借助Excel軟件以樣品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)E=10(-1/slope)-1計(jì)算擴(kuò)增效率，其中slope為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR qPCR反應(yīng)總體系為20 μL：cDNA 1 μL，Sense primer(10 μmol·L-1)1 μL，Antisense primer(10 μmol·L-1)1 μL，SYBR?Premix ExTaqTM (2×) PCR 10 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。反應(yīng)在熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))中進(jìn)行。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，Tm(表1)退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃熔解20 s，每0.5 ℃讀取1次熒光。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，陰性對(duì)照設(shè)置3個(gè)無(wú)cDNA模板的樣本。

1.2.4 內(nèi)參基因驗(yàn)證 分別以KLF3和KLF12作為目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)并合成特異引物(表1)，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)其在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)量，分別用已篩選出的最穩(wěn)定內(nèi)參基因組合和2個(gè)最不穩(wěn)定內(nèi)參基因校正KLF3和KLF12的表達(dá)，比較在不同內(nèi)參基因校正時(shí)該基因的表達(dá)變化情況。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.3。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 候選內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)分析，某一候選內(nèi)參基因各樣本Ct值減去該基因在誘導(dǎo)分化0 d時(shí)最小Ct值，得到ΔCt，以2-ΔCt值作為該基因的相對(duì)表達(dá)量數(shù)值，再利用GraphPad Prism 5軟件繪制候選內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)量圖譜；分別采用geNorm[15]、NormFinder[16]和 BestKeeper[17]程序?qū)Ω鲀?nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析；目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。geNorm和NormFinder程序?qū)朊總€(gè)候選內(nèi)參基因的相對(duì)定量數(shù)據(jù)，采用2-ΔCt法計(jì)算相對(duì)定量數(shù)據(jù)，其中ΔCt為各樣本Ct值與其對(duì)應(yīng)最小Ct值之差，ΔCt≥0，計(jì)算得到各內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定度并進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)利用geNorm程序做配對(duì)變異分析Vn/n+1結(jié)果圖。BestKeeper程序?qū)雚PCR所獲得的Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR(qPCR)

S. 正義鏈引物; A. 反義鏈引物
S. Sense primer; A. Antisense primer

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)參基因引物的擴(kuò)增效率及特異性

對(duì)GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個(gè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，均無(wú)引物二聚體，且特異性較好，說(shuō)明9對(duì)引物均能高特異性地?cái)U(kuò)增目的片段。同時(shí)由表2可知，經(jīng)5倍稀釋梯度所得內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率為66.5%～111.3%，決定系數(shù)(R2)為0.981 9～0.999 8，表明引物滿足qPCR的擴(kuò)增條件，得出的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 內(nèi)參基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量

利用qPCR檢測(cè)GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個(gè)候選內(nèi)參基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞不同誘導(dǎo)分化時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，9個(gè)基因在誘導(dǎo)分化不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量并非恒定，其中UXT、PPIA和PPIB在不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)基本一致，而18SrRNA和ACTB波動(dòng)最大(圖1)。

表2 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、決定系數(shù)R2和擴(kuò)增效率Table 2 The equation, R-square (R2) of standard curves and amplification efficiency for the reference genes

圖1 候選內(nèi)參基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression levels of candidate reference genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes

2.3 候選內(nèi)參基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期表達(dá)的穩(wěn)定性

2.3.1 geNorm程序分析結(jié)果 利用geNorm程序計(jì)算在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值(M)，M值越小表明內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好。結(jié)果，GAPDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP的M值依次為0.730、0.619、1.149、0.534、0.530、0.626、0.803、0.731和0.637，其中18SrRNA的表達(dá)水平變化相對(duì)最劇烈。依次去除最不穩(wěn)定基因后結(jié)果顯示，UXT和PPIB表達(dá)最穩(wěn)定(圖2)，且M=0.240 2。內(nèi)參基因的配對(duì)差異值Vn/n+1分析結(jié)果顯示(圖3)，V2/3<0.15，說(shuō)明在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，使用2個(gè)內(nèi)參基因(UXT和PPIB)即可達(dá)到準(zhǔn)確校正目標(biāo)基因表達(dá)的目的，無(wú)需引入更多內(nèi)參基因。

圖3 利用geNorm程序分析候選內(nèi)參基因的配對(duì)變異系數(shù)Fig.3 The pairwise variations of candidate reference genes by geNorm program

2.3.2 NormFinder程序分析結(jié)果 利用NormFinder程序?qū)APDH、PPIA、18SrRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP等9個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定值(S)進(jìn)行計(jì)算及分析，結(jié)果指出(表3)，與其他候選內(nèi)參及因相比UXT基因具有最小的S值(S=0.109)，表明該基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定，其次表達(dá)較穩(wěn)定的基因?yàn)镻PIB和RPLP0，18SrRNA表達(dá)最不穩(wěn)定(S=0.505)。同時(shí)NormFinder程序提供兩個(gè)內(nèi)參基因同時(shí)使用的最佳組合為UXT和PPIB基因，穩(wěn)定值為0.106。

2.3.3 BestKeeper程序分析結(jié)果 利用BestKeeper程序分析獲得各基因相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(表4)，根據(jù)前人判定原則[18]可知，9個(gè)候選內(nèi)參基因中，PPIB基因表達(dá)最穩(wěn)定，其次為UXT和PPIA，18SrRNA表達(dá)最不穩(wěn)定。由表5可知，GAPDH與ACTB和PPIB與UXT的相關(guān)系數(shù)最大，根據(jù)GAPDH、ACTB、PPIB和UXT基因各自的穩(wěn)定性，最終確定同時(shí)使用兩個(gè)內(nèi)參基因的最佳組合為PPIB和UXT。

表3 利用NormFinder程序分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值Table 3 The stability values of candidate reference genes by NormFinder program

2.4 山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中內(nèi)參基因表達(dá)的綜合分析

為綜合3個(gè)程序的分析結(jié)果，對(duì)誘導(dǎo)分化不同時(shí)間段的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性等級(jí)進(jìn)行了平均值計(jì)算，9個(gè)候選內(nèi)參基因GAPDH、ACTB、EIF3K、PPIA、PPIB、UXT、TBP、RPLP0和18SrRNA的穩(wěn)定性等級(jí)排序的平均等級(jí)為6.0、6.3、7.3、3.6、1.7、1.3、4.6、5.0和9.0(表6)。由此可見，在誘導(dǎo)分化過(guò)程中UXT基因的表達(dá)穩(wěn)定性相對(duì)最好，其次為PPIB基因，而18SrRNA表達(dá)水平最不穩(wěn)定。綜合考慮3個(gè)程序?qū)蚍€(wěn)定性及配對(duì)分析可得，UXT和PPIB為最佳內(nèi)參組合以校正目標(biāo)基因表達(dá)量。

表4 利用BestKeeper程序分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 The expression stability of candidate reference genes by BestKeeper program

表5 利用BestKeeper程序分析候選內(nèi)參基因間的相關(guān)系數(shù)Table 5 The correlation coefficients among candidate reference genes by BestKeeper program

2.5 山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中內(nèi)參基因的表達(dá)驗(yàn)證

為了進(jìn)一步探索應(yīng)用最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定內(nèi)參基因進(jìn)行校正時(shí)是否存在差異，分別以UXT和PPIB的幾何平均數(shù)、UXT、EIF3K和18SrRNA為內(nèi)參基因，分析LKF3和KLF12在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖4)，在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，以UXT和PPIB的幾何平均數(shù)和UXT為校正因子時(shí)，KLF3的表達(dá)模式相同，均呈降低(0～3 d)后升高(5 d)再降低(6 d)的趨勢(shì)；以EIF3K為校正因子時(shí)，大致趨勢(shì)與前者相同，但在2和3 d時(shí)表達(dá)量下調(diào)(分別下調(diào)0.76和0.70倍)；而以18SrRNA為校正因子時(shí)，KLF3的表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì)。KLF12出現(xiàn)相同變化，以UXT和PPIB的幾何平均數(shù)、UXT和EIF3K為校正因子時(shí)表達(dá)模式相同，但EIF3K校正時(shí)KLF12表達(dá)量下調(diào)，而18SrRNA為校正因子時(shí)KLF12表達(dá)模式發(fā)生變化，峰值出現(xiàn)在分化1 d的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞(上調(diào)1.34倍)。

表6 利用3種程序分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性等級(jí)排序Table 6 Overall stability ranks of candidate reference genes by 3 programs

A和C表示分別以UXT&PPIB、18S rRNA和EIF3K為內(nèi)參基因時(shí)，KLF3和KLF12在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)水平；B和D表示分別以UXT&PPIB和UXT為內(nèi)參基因時(shí)，KLF3和KLF12在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)水平A and C represent the expression levels of KLF3 and KLF12 genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes when UXT&PPIB, 18S rRNA and EIF3K were used as reference genes; B and D represent the expression levels of KLF3 and KLF12 genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes when UXT&PPIB and UXT were used as reference genes圖4 不同內(nèi)參基因校正下KLF3和KLF12在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)水平Fig.4 The expression levels of KLF3 and KLF12 genes normalized by different reference genes in different differentiation periods of goat intramuscular preadipocytes

3 討 論

qPCR技術(shù)是檢測(cè)基因表達(dá)水平最常用的手段，而內(nèi)參基因的選擇直接影響了其結(jié)果的準(zhǔn)確性。但大量的研究證明，這些內(nèi)參基因是在特定條件下穩(wěn)定表達(dá)，內(nèi)參基因的盲目選擇會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果不真實(shí)[19]。例如在蛋雞不同組織中核糖體蛋白S2(Ribosomal protein S2，RPS2)和ACTB基因表達(dá)相對(duì)更穩(wěn)定[20]；而TBP、核糖體蛋白L4(Ribosomal protein L4，RPL4)基因則是在豬肌肉組織中相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因[21]；李迪等[22]在校正鱖魚qPCR結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-2-微球蛋白(Beta-2 microglobulin，B2M)和核糖體蛋白L13a(Ribosomal protein L13a，RPL13a)表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定；在關(guān)于綿羊的研究中發(fā)現(xiàn)，GAPDH、SDHA和ACTB適合于大腦、G6PDH、ACTB和YWHAZ適合于小腦，而SDHA、核糖體蛋白L19(Ribosomal protein L19，RPL19)和GAPDH適合于腸系膜淋巴結(jié)中校正目標(biāo)基因表達(dá)[23]。因此具有針對(duì)性的篩選內(nèi)參基因具有重要意義。本試驗(yàn)利用qPCR技術(shù)檢測(cè)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)發(fā)現(xiàn)(圖1)，UXT、PPIB和PPIA表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，18SrRNA和ACTB變化最大。因此為了進(jìn)一步確定最優(yōu)內(nèi)參基因，本研究分別利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper程序?qū)?個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

研究者多用geNorm、NormFinder和 BestKeeper等程序來(lái)專門評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。J. Vandesompele 等[15]于2002年編寫了geNorm程序，該程序可用于任何試驗(yàn)條件下篩選最適內(nèi)參基因，并選出最優(yōu)內(nèi)參基因組合以校正目標(biāo)基因表達(dá)。geNorm程序根據(jù)各內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算穩(wěn)定值M以及配對(duì)變異Vn/n+1值，M值越小則內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定，Vn/n+1值小于0.15時(shí)最適內(nèi)參基因個(gè)數(shù)為n，反之則為n+1。C.L.Andersen等[16]于2004年編寫了NormFinder程序，運(yùn)行該程序所得穩(wěn)定值S是通過(guò)計(jì)算各內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)量而獲得，該值越小內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好；同年M.W.Pfaffl等[17]編寫了BestKeeper程序，該程序不僅可以分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，而且還可以對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行分析，輸入qPCR原始數(shù)據(jù)，運(yùn)行得到內(nèi)參基因間相關(guān)系數(shù)、變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。本研究結(jié)果經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，3種程序分析結(jié)果并不相同，geNorm和NormFinder程序分析顯示UXT表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定，而BestKeeper程序分析發(fā)現(xiàn)PPIB表達(dá)更穩(wěn)定，3個(gè)程序分析結(jié)果均表明，使用UXT和PPIB基因即可準(zhǔn)確校正在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化不同時(shí)期目標(biāo)基因的表達(dá)水平；且在本試驗(yàn)條件下最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為18SrRNA。

為了最終確定適合于山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化的最適內(nèi)參基因，本試驗(yàn)綜合分析了9個(gè)候選基因的穩(wěn)定等級(jí)排名發(fā)現(xiàn)，在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化不同時(shí)期UXT基因表達(dá)水平相對(duì)最穩(wěn)定，最不穩(wěn)定基因?yàn)?8SrRNA，并且應(yīng)用UXT和PPIB組合作為內(nèi)參基因校正目標(biāo)基因表達(dá)更準(zhǔn)確。UXT是PFD(α-class prefoldin)蛋白家族成員之一[24]，是在動(dòng)物研究中受不同物種、組織、試驗(yàn)環(huán)境影響差異較小的內(nèi)參基因之一。M. Bonnet等[2]研究發(fā)現(xiàn)，UXT基因在牛和山羊的乳腺、肝和脂肪組織中表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定。UXT基因表達(dá)的穩(wěn)定性不受日糧[25]和泌乳周期[26]影響，適合作為圍產(chǎn)期、泌乳期奶牛乳腺組織的內(nèi)參基因。在關(guān)于牦牛乳體細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S9(Ribosomal protein S9，RPS9)、蛋白磷酸酶1調(diào)控亞基11(Protein phosphatase 1 regulatory subunit 11，PPP1R11)、UXT和線粒體核糖體蛋白L39(Mitochondrial ribosomal protein L39，MRPL39)為穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，UXT是山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化不同時(shí)期表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定的基因，為UXT基因作為一種較為普遍使用的內(nèi)參基因提供了佐證，但也有研究提出，UXT并不適合作為荷斯坦奶牛乳體細(xì)胞的內(nèi)參基因[27]，所以每一物種不同細(xì)胞或者組織內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因都需要通過(guò)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。PPIB是肽酰脯氨基順?lè)串悩?gòu)酶(Peptidylproyl isomerase，PPI)家族的成員，與PPIA高度同源，在體內(nèi)分布廣泛，與自身免疫性疾病密切相關(guān)[28-29]。PPIB基因與ACTB和GAPDH相比，更適合作為人外周血液的內(nèi)參基因[30]。本團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)，PPIB和羥甲基膽素合酶(Hydroxymethyl-bilane synthase，HMBS)是成都麻羊和簡(jiǎn)州大耳山羊不同部位肌肉組織中相對(duì)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[18]。這些研究結(jié)果為其他物種、細(xì)胞及試驗(yàn)條件下以PPIB作為候選內(nèi)參基因提供了參考。

為了確定本試驗(yàn)篩選得到的適合研究山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的內(nèi)參基因及組合，需要以特定的目標(biāo)基因來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。KLF3和KLF12是KLF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是脂肪細(xì)胞分化的最重要調(diào)控方式，本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表明，KLF3和KLF12可能參與山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程，因此本試驗(yàn)選擇二者作為目標(biāo)基因來(lái)驗(yàn)證所篩選內(nèi)參基因的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，將UXT和PPIB的幾何平均數(shù)、UXT和EIF3K基因用于歸一化分析時(shí)，KLF3和KLF12的表達(dá)模式未發(fā)生變化，相對(duì)于UXT和PPIB而言EIF3K作為內(nèi)參時(shí)目標(biāo)基因的表達(dá)量降低。以18SrRNA作為內(nèi)參基因，KLF3和KLF12的表達(dá)模式均發(fā)生變化。因此，當(dāng)選用不同內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化分析時(shí)，KLF3和KLF12的表達(dá)模式有很大差異，說(shuō)明需要準(zhǔn)確的篩選內(nèi)參基因以得到正確的目標(biāo)基因的表達(dá)變化，并不能盲目的選用常用內(nèi)參基因18SrRNA進(jìn)行分析。近年來(lái)也有一些研究報(bào)道了18SrRNA在一些物種、組織和試驗(yàn)條件下不適合作為內(nèi)參基因。比如W.Z.Zhu等[18]發(fā)現(xiàn)，18SrRNA是山羊背最長(zhǎng)肌和股二頭肌表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；此外，18SrRNA在山羊小腸組織中也不能穩(wěn)定表達(dá)[7]，在山羊不同日齡及不同部位的小腸黏膜中的表達(dá)同樣不穩(wěn)定[10]。在關(guān)于新西蘭白兔[31]等內(nèi)參篩選中也得到了相似的結(jié)果。因此，本研究結(jié)果表明，UXT和PPIB組合為最適合研究山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程的內(nèi)參基因，這為后續(xù)闡明山羊IMF沉積分子機(jī)理數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性提供了重要的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功篩選出山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期的內(nèi)參基因，最佳選擇為UXT，而18SrRNA穩(wěn)定性相對(duì)較差，不適合作為相關(guān)研究的內(nèi)參基因。同時(shí)使用2個(gè)內(nèi)參對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行校正的最適內(nèi)參組合為UXT和PPIB，該研究結(jié)果為檢測(cè)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中目標(biāo)基因的表達(dá)提供了內(nèi)參依據(jù)。

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