剝奪小鼠睡眠后促覺醒中樞TMN內小膠質細胞在睡眠-覺醒中的變化

洪　艷，施　伍，梁　悅，李曉鳳，王　媛，許　奇，伍龍軍，王烈成

長期以來,人們對于中樞睡眠和覺醒系統的研究,主要集中在眾多的神經核團及其遞質上。這些核團和遞質彼此間形成相互作用、相互制約的神經網絡。目前認為，下丘腦腹外側視前區(ventrolateral preopticnucleus nucleus，VLPO)與結節乳頭體核(tuberomammillary nucleus，TMN)分別是重要的促睡眠和促覺醒的調節中樞[1-2]。隨著研究的深入，小膠質細胞作為中樞神經系統中重要的免疫功能細胞，其在中樞神經系統新的功能作用不斷地被發現。小膠質細胞是否也在睡眠-覺醒調控中起作用卻很少報道。睡眠剝奪常被作為研究睡眠-覺醒機制的一種重要研究方法[3]。該研究采用睡眠剝奪方式，使用已被證明可以抑制小膠質細胞活化的四環素類抗生素藥物-米諾環素[4],探討小膠質細胞在睡眠-覺醒穩態調節中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和分組SPF級雄性8周齡C57BL/6小鼠共50只，25～28 g。均由北京維通利華提供，按不同組別將實驗小鼠置于動物房的獨立通風籠盒內飼養，光照8：00～20：00，溫度適宜，能夠自由攝食飲水。實驗一：為了觀察米諾環素對正常睡眠小鼠是否有影響，將小鼠分為生理鹽水自然睡眠組(NS-TODS 組)和米諾環素自然睡眠組(mino-TODS組)，即在正式實驗的第1～7天，早上8:00分別給兩組小鼠腹腔注射生理鹽水和米諾環素75 mg/kg。為了觀察米諾環素對睡眠剝奪小鼠是否有影響，將小鼠分為NS-TODS 組、睡眠剝奪生理鹽水組(NS-SD組)和睡眠剝奪米諾環素組(mino-SD組)。NS-TODS 組僅注射生理鹽水，不做其它特殊處理，另外兩組是在分別連續注射生理鹽水和米諾環素第7天后剝奪睡眠后行多導睡眠描記。實驗二：為了觀察小鼠在TMN腦區小膠質細胞熒光表達情況，同樣實驗條件下，連續腹腔注射生理鹽水和米諾環素7 d以后，NS-SD組和mino-SD組行睡眠剝奪，NS-TODS 組僅注射生理鹽水自然睡眠5 h后，3組小鼠麻醉后行多聚甲醛灌流。

1.1.2儀器68030型小鼠腦立體定位適配器、高速顱骨鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；MP150多導生理信號記錄分析系統(美國Biopac公司)；Sleepsign睡眠分析軟件(日本KisseiComte株式會社)；免疫熒光相關試劑(日本TaKaRa公司)；電極用銀絲(美國CoonerWire公司)；造牙粉、義齒基托樹脂(上海二醫張江生物材料有限公司)；記錄排線(東莞市耀博電子有限公司)；萊卡冰凍切片機DM1860、萊卡DM2500 熒光顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.1.3試劑戊巴比妥鈉(上海化學試劑采購供應站分裝廠進口分裝)用蒸餾水配成0.04 g/L溶液；米諾環素(美國Sigma公司)；一抗：iba-1 兔源(日本Wako公司)；二抗：Alexa488 驢抗兔(美國Invitrogen 公司)，驢血清，冰凍切片包埋劑，防猝滅封片劑。

1.2方法

1.2.1動物手術小鼠經戊巴比妥行腹腔麻醉后固定于小鼠腦立體定位適配器上，將小鼠頭頂毛剪去，酒精消毒皮膚并剪開，血管夾夾緊切口兩側皮膚，分離皮下組織，用生理鹽水洗凈后使顱骨完全暴露，分別位于前囟前1.0 mm、旁開1.5 mm和后囟前1.0 mm、旁開1.5 mm處用顱骨鉆鉆通顱骨，但不弄破硬腦膜，將腦電電極埋入，兩根肌電電極分別插入兩側的頸部肌肉內。用牙科水泥將電極固定于顱骨上，腹腔注射青霉素，縫合傷口，將小鼠側臥位放入屏蔽箱恢復籠內。

1.2.2多導睡眠描記方法小鼠手術后放入恢復籠內恢復7 d，第8天將小鼠頭部電極通過所焊的記錄排線與多通道萬向輪連接，適應3 d后，正式記錄。屏蔽箱內光照8:00～20:00，記錄從早8：00(記為ZT0)開始，用Acqknowlege4.2軟件記錄小鼠的腦電肌電活動，記錄過程中小鼠能夠自由飲食和攝水，活動不受限制。每次描記均從8:00開始，連續記錄24 h。

1.2.3睡眠狀態數據統計標準腦電數據以4 s為時間段分析，將睡眠覺醒周期分為覺醒(wakefulness，W)，以低幅快波腦電和明顯肌電活動為特征；非快動眼睡眠(non-rapid eye movement，NREM)，以高幅慢波腦電和肌電活動明顯減少為特征；快動眼睡眠(rapid eye movement，REM)，以低幅慢波腦電和肌電安靜為特征；總睡眠時間(total sleep time，TST)是 REM 睡眠和 NREM 睡眠時間之和。

1.2.4睡眠剝奪方法睡眠剝奪時將小鼠置于有機玻璃圓桶(直徑22 cm，高38 cm)，從8：00 ～ 13：00 (ZT 0～5)對小鼠每隔15 s 用毛刷輕輕觸碰小鼠臀部，小鼠被強迫保持清醒狀態，以此達到睡眠剝奪的目的。此方法對小鼠的應激水平較低，可以完全剝奪NREM睡眠和REM睡眠，較容易觀察小鼠睡眠剝奪后的反應，所以本實驗采用的是觸碰法[3]。

1.2.5冰凍腦組織制備小鼠麻醉后，經左心室插管行心內灌注固定。由胸骨劍突入刀，剪開胸腔充分暴露心臟包膜，用眼科剪刀剪開心包膜暴露整個心臟，止血鉗夾閉下腔靜脈，然后左心室插入輸液器針頭，迅速剪開右心耳。灌注分為兩部分：先快速灌注4 ℃生理鹽水，至流出液體變清；隨即灌注固定液4%的多聚甲醛(用PBS緩沖液配制)。灌注速度先快后慢，約20～30 min灌完。待僵硬后取出組織(較為完整的小鼠腦)，灌流完成。將取出的腦組織置于4%多聚甲醛(PBS緩沖液配制)中固定24 h，然后分別置于含10%、20%和30%蔗糖的PBS中脫水，待組織沉底后方可進行冰凍切片。

1.2.6冰凍切片將用包埋劑包埋的腦組織迅速冰凍后進行腦切片。切片的厚度為30 μm，對照小鼠腦立體定位圖譜(第二版,George Paxinos, Keith B J Frallklin),選取小鼠含有TMN腦區(圖1A)，視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)腦區的腦片放置于4 ℃冰箱保存(圖1B)。

圖1　對照圖譜選擇TMN、SCN腦片示意圖

1.2.7TMN和SCN中小膠質細胞免疫熒光檢測將含有TMN和SCN腦切分別用0.01 mol/L PBS清洗和0.3% TritonX-100通透處理后，再分別用一抗和二抗孵育。一抗為iba-1，小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體；二抗為Alexa fluor488，綠色熒光標志物。

1.2.8定量分析小膠質細胞直徑和光密度高倍鏡視野(×40倍鏡) 下分別采集3個 SCN和TMN 區域圖像，使用 ImageJ-win32/fiji分析軟件處理圖像，用平均熒光密度(area of interest，AOI)值、細胞平均直徑、細胞個數反映各腦區蛋白表達水平。

2　結果

2.1米諾環素對自然睡眠小鼠睡眠-覺醒的影響自然睡眠狀態下小鼠分別腹腔注射生理鹽水和米諾環素7 d ，采用自由活動腦電24 h連續監測，結果顯示NS-TODS組和mino-TODS組的覺醒、REM睡眠以及NREM睡眠呈晝夜節律變化，兩者之間差異無統計學意義(圖2)。

圖2　NS-TODS組和 mino-TODS組小鼠的24 h睡眠-覺醒統計圖

A：兩組小鼠覺醒量分布圖；B：兩組小鼠24 h總覺醒量統計圖；C：兩組小鼠REM 睡眠量分布圖； D：兩組小鼠24 h總REM睡眠時間統計圖； E：兩組小鼠NREM睡眠量分布圖； F：兩組小鼠24 h總NREM睡眠時間統計圖

圖3　睡眠剝奪5 h后NS-TODS組和NS-SD組小鼠的覺醒、REM睡眠和NREM睡眠時間的變化

A：兩組小鼠ZT 5～11覺醒量分布圖；B：兩組小鼠ZT 5～11 REM睡眠量分布圖；C：兩組小鼠ZT 5～11 NREM睡眠量分布圖；與NS-TODS組比較：*P<0.05

圖4　睡眠剝奪5 h后NS-SD組和mino-SD 組小鼠的覺醒-睡眠量統計

A：兩組小鼠ZT 5～11覺醒量分布統計圖；B：兩組小鼠ZT 5～6覺醒量統計圖；C：兩組小鼠ZT 5～11睡眠量分布統計圖；D：兩組小鼠ZT 5～6睡眠量統計圖；與NS-SD組比較：*P<0.05

2.2睡眠剝奪后對小鼠睡眠-覺醒的影響在腹腔連續注射生理鹽水第7天后剝奪小鼠睡眠5 h，然后開始記錄7 h的小鼠腦電(ZT 5～11)。結果顯示，與NS-TODS組相比，NS-SD組小鼠覺醒量有所減少，NREM睡眠量有所增加，差異有統計學意義(圖3)。

2.3腹腔注射米諾環素對睡眠剝奪小鼠睡眠-覺醒的影響同樣，在腹腔連續注射米諾環素第7天后剝奪小鼠睡眠5 h，然后進行多導睡眠記錄。與NS-SD組(13.30±2.378)相比，mino-SD組在ZT 5～6的時間段內，其覺醒總量(23.10±1.768)有顯著性增加(P<0.05)。而在ZT 6～11時段內，沒有顯著性變化(圖4 A、B)。對睡眠總量進行統計，結果顯示mino-SD組在ZT 5～6時間段內，其TST睡眠總量(41.87±4.616)較NS-SD組(31.60±2.298)有明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05),而ZT6～11時間段內，沒有顯著性變化(圖4 C、D)。

2.4睡眠剝奪后小鼠TMN和SCN腦區小膠質細胞的活力變化

2.4.1睡眠剝奪后小鼠TMN腦區小膠質細胞的活力變化經過7 d腹腔注射米諾環素和生理鹽水，NS-TODS組小鼠自然睡眠5 h， NS-SD組、 mino-SD組小鼠睡眠剝奪5 h后即給予小鼠麻醉，制備冰凍切片。通過iba-1免疫熒光染色后，高倍熒光鏡下觀察，可見TMN區域小膠質細胞呈現綠色，細胞容易辨認，結構清晰，突起分明(圖5 A-C)。NS-SD組小膠質細胞較NS-TODS組胞體更大，分支數目多，分支長度更長，熒光強度更亮。與mino-SD組相比，mino-SD組小膠質細胞明顯細胞胞體變小，分支數目減少，長度變短。再將3組TMN區域的小膠質細胞的直徑、熒光強度和數量進行統計，與NS-TODS組相比，NS-SD組小膠質細胞直徑較大(t=3.747,P<0.01)，熒光強度較強(t=2.326,P<0.05)，而mino-SD組小膠質細胞和NS-SD組相比,有變小的趨勢，但差異無統計學意義。見圖4 D-F。

2.4.2米諾環素對睡眠剝奪小鼠SCN腦區小膠質細胞活力的影響同條件下NS-TODS組、NS-SD組和mino-SD組小鼠冰凍切片通過iba-1免疫熒光染色后，高倍熒光鏡下觀察，可見SCN區域小膠質細胞呈現綠色，細胞容易辨認，結構清晰，突起分明(圖6 A-C)，從細胞胞體、細胞分枝數目、長度、熒光亮度對比，并未見明顯差別，將3組SCN區域的小膠質細胞的直徑、熒光強度和數量進行統計，3組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6 D-F。

3　討論

已有研究[5]顯示免疫系統對睡眠是有一定的影響，但此影響是否與腦中的先天的免疫細胞-小膠質細胞有關還是未知的。小膠質細胞是中樞神經系統的常駐吞噬細胞，通過持續監測周圍的微環境，感知神經元活動，在細胞受傷和死亡后清除神經元碎片，促進健康大腦發育性突觸的修剪[6]。任何對腦內穩態的干擾，包括炎癥，都會激活小膠質細胞，急性和慢性睡眠剝奪可導致無明顯感染或損傷的促炎狀態[7]。文獻報道，在人類和嚙齒類動物中，睡眠缺失會導致白細胞計數升高，c-fos蛋白，IL-1，IL-6，TNF的增加[8]，血腦屏障增強通透性增加等[9]。小膠質細胞特異性抑制劑，米諾環素，已被證明可以通過血腦屏障，抑制細胞因子、一氧化氮和前列腺素等產物的產生，減弱大腦由于這些產物造成的神經化學變化[10]。因此，本實驗采用腹腔注射米諾環素的方法抑制小膠質細胞的活性來檢測小膠質細胞在睡眠覺醒調控中的作用。實驗結果提示該抑制劑對正常睡眠小鼠的睡眠結構沒有明顯的影響。

圖5　NS-TODS組、NS-SD組和mino-SD組小鼠TMN區域小膠質細胞的熒光表達情況

A：NS-TODS組小鼠TMN區域的熒光圖；B：NS-SD組小鼠TMN區域的熒光圖；C：mino- SD組小鼠TMN區域的熒光圖；D：3組TMN區域小膠質細胞直徑統計圖；E：3組TMN區域小膠質細胞熒光強度統計圖；F：3組TMN區域小膠質細胞數量統計圖；與NS-TODS組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖6　NS-TODS組、NS-SD組和mino-SD組小鼠SCN區域小膠質細胞的熒光表達情況

A：NS-TODS組小鼠SCN區域的熒光圖；B：NS -SD組小鼠SCN區域的熒光圖；C： mino-SD組小鼠SCN區域的熒光圖；D：3組SCN區域小膠質細胞直徑統計圖；E：3組SCN區域小膠質細胞熒光強度統計圖；F：3組SCN區域小膠質細胞數量統計圖

實驗的第7天給予睡眠剝奪后，與注射鹽水組相比，注射米諾環素組早期出現覺醒的急性增加，可以推斷早期米諾環素抑制了小膠質細胞的活化，從而減少由于小膠質細胞活化導致的炎癥反應，覺醒增多，睡眠減少。Iba-1是小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體，通過觀察Iba-1的表達，反應小膠質細胞形態和不同狀態下的的活力[11]，睡眠剝奪與自然睡眠組相比較，在TMN，促覺醒腦區，小膠質細胞的平均直徑增大、亮度增強，提示此腦區中的小膠質細胞活躍程度增加。由此推測睡眠剝奪階段，由于覺醒腦區的持續激活，代謝產物，如細胞因子、一氧化氮和前列腺素等不斷堆積，導致覺醒區域的小膠質細胞增大，變亮，作為免疫吞噬細胞來清除這些產物，以保護覺醒神經元的過度激活。同時實驗結果還顯示，應用小膠質細胞抑制劑米諾環素組的小鼠睡眠剝奪后小膠質細胞變小，亮度有變暗的趨勢，但差異無統計學意義。可以進一步推斷米諾環素減弱了小膠質細胞的活化作用，在促覺醒腦區TMN區，小膠質細胞對覺醒-睡眠的調節起了一定的作用。

同時本實驗還觀察了和覺醒無關的腦區，反應晝夜節律的腦區-視交叉上核(SCN)中小膠質細胞的標志物iba-1的表達情況，統計結果顯示SCN區域小膠質細胞的直徑、熒光強度和數量在3組實驗動物未見明顯差異。說明在小膠質細胞在此區域在此實驗條件下并未對晝夜節律的調節發生明顯改變。

通過此實驗推測，小膠質細胞在過度激活狀態下對睡眠-覺醒的穩態有調控作用，米諾環素抑制小膠質細胞活性，維持覺醒，延遲覺醒向睡眠推進的時間。

參考文獻