白藜蘆醇在體外通過自噬作用抑制宮頸癌細胞增殖的研究

孫傳名，方文秀，周榮生，汪陶榮，趙衛東，陳曉宇

宮頸癌是女性生殖系統最為常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈逐年升高趨勢[1]。植物抗毒素白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從花生、虎杖、葡萄等植物中提取的多元酚類，生物學和藥理學活性廣泛，研究[2-3]顯示其具有抗炎、抗氧化、預防腫瘤和抗老化等特性。真核生物體內細胞內衰老、變性、受損的細胞器需依賴細胞內自噬-溶酶體途徑降解，從而調節細胞器質量，穩定細胞內環境，防止致突變物質聚集于細胞或發生基因突變[4]。Res抗宮頸癌HeLa細胞作用已有文獻[5]報道，但關于自噬在Res對宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制中的作用研究報道較少。該研究在體外采用不同濃度Res處理人宮頸癌HeLa 細胞，檢測Res對HeLa 細胞的增殖抑制和促進凋亡作用，同時，檢測Res誘導HeLa 細胞自噬情況，探討Res對宮頸癌HeLa 細胞部分作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗試劑和主要儀器白藜蘆醇(純度≥99%，美國Aladdin Sigma公司，用時稀釋于培養液)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Genview公司)；培養基RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；二甲亞砜(DMSO)、Hoechst 33258染液、青霉素和鏈霉素溶液、蛋白預染Marker、一抗稀釋液、ECL化學發光液(上海碧云天生物有限公司)；BCA蛋白試劑定量盒(美國Pierce公司)；一抗：兔抗人微管相關蛋白1的輕鏈3(light chain 3 of the microtubule associated protein 1，LC3A/B)、p62、Beclin-1、GAPDH多克隆抗體(美國Cell signaling 公司)；二抗：辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔多克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)；硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜(美國Millipore公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；CO2培養箱、多功能酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國Lecia公司)；半干轉膜儀(大連競邁生物科技有限公司)。

1.2宮頸癌HeLa細胞培養和細胞增殖實驗HeLa 細胞株常規培養于含10% FBS的RPMI-1640培養液中(內置1%青霉素和鏈霉素雙抗)，置于37 ℃、5% CO2孵箱中單層傳代培養。按照5×103/孔將處于對數生長期的HeLa 細胞接種于96孔細胞培養板中。HeLa細胞分為對照組、白藜蘆醇組。對照組只加RPMI-1640培養液，白藜蘆醇組(加入Res 5、10、20、50、100 μmol/L處理)，細胞培養48 h后，加入MTT溶液繼續培養4 h，再用DMSO 振蕩溶解，于波長490 nm下酶標儀讀取吸光度(absorbance，A)值即A490值。按下列公式計算增殖抑制率：增殖抑制率(%)= (對照組A490-白藜蘆醇組A490)/對照組A490×100 %。

1.3Hoechst33258染色檢測Res處理HeLa細胞后的細胞凋亡情況取對數生長期的HeLa細胞，按照5×103/孔接種于96孔細胞培養板中，貼壁培養24 h后，予不同濃度Res(0、5、30、100 μmol/L)處理48 h，吸盡培養液，4%多聚甲醛溶液固定15 min， PBS清洗固定后的HeLa細胞2次，每次10 min，棄去清洗液并吸干，30 μl染色液Hoechst 33258避光染色10 min，PBS清洗，2次，每次10 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4免疫細胞化學觀察Res處理HeLa細胞后LC3A/B抗體表達按照1.0×105/孔將處于對數生長期的HeLa 細胞接種于6孔細胞培養板中，培養24 h后，加入Res，使其終濃度為20、100 μmol /L，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，吸盡培養液，4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS漂洗HeLa細胞3次，每次10 min。加入0.1% TritonX-100 透膜10 min，PBS 漂洗HeLa細胞3次，每次10 min。山羊血清封閉1 h，勿洗，加入1 ∶150稀釋的兔抗人LC3A/B多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日PBS 漂洗3次，每次10 min后，加入1 ∶100 稀釋的FITC 標記羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次10 min；加入DAPI 染核5 min，應用抗熒光淬滅劑封固，Lecia激光共聚焦顯微鏡攝片。

1.5Westernblot法檢測Res處理HeLa細胞后p62、Beclin-1蛋白表達25 ml培養瓶中按照1.0×106/孔將處于對數生長期的HeLa 細胞接種，每瓶加入含10% FBS的RPMI-1640培養液5 ml，培養24 h 后，加入不同濃度Res(0、10、30、100 μmol /L)處理48 h，RIPA裂解液提取總蛋白，Bradford 法測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白SDS-PAGE電泳(分離膠10%， 濃縮膠5%)分離，半干轉膜儀轉移至PVDF膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，在4 ℃孵育p62、Beclin-1 蛋白一抗過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發光，曝光壓片，顯影、定影。Alpha 化學發光凝膠成像系統照相記錄結果。

2 結果

2.1不同濃度白藜蘆醇對HeLa細胞增殖情況的影響將對照組(只RPMI-1640 培養液)的細胞增殖的抑制率設為0，與對照組比較，白藜蘆醇組(加入Res 5、10、20、50、100 μmol/L)處理后，HeLa細胞增殖的抑制率逐漸增高，分別為(9.2%±1.5%)、(13.4%±1.7%)、(20.1%±2.1%)、(32.6%±2.3%)、(40.4%±2.8%)，與對照組比較，差異有統計學意義(F=38.17，P<0.01)，見圖1。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對HeLa 細胞增殖情況的影響

2.2Res處理HeLa細胞后的細胞凋亡情況倒置顯微鏡下，與對照組(0 μmol/L Res)相比，HeLa細胞經過不同濃度Res溶液(5、30、100 μmol/L)刺激48 h 后，HeLa細胞則呈不規則梭形、巢狀聚團生長。熒光顯微鏡下，Hoechst 33258 染色后于觀察可見，細胞核變形或皺縮，核染色質進一步聚集、斷裂，呈月牙狀或明亮顆粒狀藍色熒光，可見明顯凋亡小體。且隨著Res濃度的升高，核凋亡現象更加明顯。見圖2。

圖2 不同濃度Res處理HeLa細胞后的細胞凋亡情況 Hoechst 33258染色×100

2.3Res處理HeLa細胞后LC3A/B表達的影響在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，LC3A/B 綠色熒光較為均勻的分布于對照組HeLa 細胞的胞質和胞核中，熒光強度相對較弱；不同濃度的Res處理HeLa細胞后，HeLa 細胞的胞質和胞核中LC3A/B 綠色熒光強度明顯增強，且較不均勻，以Res高濃度(100 μmol /L)明顯，見圖3。

2.4Westernblot法檢測Res處理HeLa細胞后p62和Beclin-1蛋白表達情況Western blot 檢測結果表明，與對照組比較，使用白藜蘆醇不同濃度(10、30、100 μmol /L)處理HeLa 細胞48 h 后，隨著白藜蘆醇濃度增高，p62 蛋白表達逐漸降低，而Beclin-1 表達逐漸增強。經統計分析表明，與對照組p62 蛋白表達(0.46±0.09)比較，不同濃度白藜蘆醇(10、30、100 μmol /L)處理HeLa 細胞的p62 蛋白表達(0.35±0.08)、(0.29±0.06)、(0.22±0.05)差異有統計學意義(F=25.71，P<0.01)；與對照組Beclin-1蛋白表達(0.18±0.05)比較，不同濃度白藜蘆醇(10、30、100 μmol /L)處理HeLa 細胞的Beclin-1 蛋白表達(0.29±0.07)、(0.41±0.08)、(0.53±0.11)差異有統計學意義(F=42.07，P<0.01)。見圖4。

圖3 不同濃度Res處理HeLa細胞后LC3A/B 表達激光共聚焦 ×400

A：對照組；B：Res 5 μmol/L；C：Res 30 μmol/L；D：Res 100 μmol/L

圖4 Res處理HeLa細胞后p62 和Beclin-1 蛋白表達影響

1：對照組；2：Res 5 μmol/L；3：Res 30 μmol/L；4：Res 100 μmol/L；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

婦科惡性腫瘤宮頸癌發病率高、惡性程度大，我國每年約有2萬余名婦女死于宮頸癌[1]。為改善宮頸癌患者預后，降低放療、化療副反應和復發率，科研人員作出不斷研究。天然的多酚類化合物Res具有廣泛的生物學和藥理學活性，在植物虎杖、葡萄、花生等廣泛分布芪類化合物，研究[2,6]顯示其具有抗氧化、抗炎作用，可顯著抑制肺癌、乳腺癌、神經膠質細胞瘤、肝癌、腎癌等多種腫瘤細胞生長。本研究通過人宮頸癌HeLa細胞為對象，觀察Res對宮頸癌細胞生長的影響。MTT檢測結果表明，不同劑量Res對宮頸癌HeLa 細胞增殖有抑制作用，該抑制作用呈劑量依賴性。

細胞凋亡是細胞在基因調控下，為適應外界環境的影響主動程序死亡的過程，在腫瘤的發生發展關系密切，形態學上，凋亡細胞變形且體積縮小，貼壁培養細胞會出現變圓、皺縮、脫落，細胞核染色質濃縮、邊聚，分割成塊狀和凋亡小體等。Hoechst 33258是常用的DNA特異性染料，與DNA非嵌入式的結合DNA的A-T堿基區，通過熒光顯微鏡，紫外光激發時發射明亮的藍色熒光[7]。本研究在Hoechst 33258 染色熒光顯微鏡下觀察到，Res處理組宮頸癌HeLa 細胞的胞核變形或皺縮，核染色質聚集呈月牙狀或明亮顆粒狀藍色熒光，且隨著Res濃度的升高，核凋亡現象更加明顯。表明不同劑量Res可促進宮頸癌HeLa 細胞凋亡形成。

惡性腫瘤的發展進程中會表現出自噬功能失調，且與其損傷DNA、降低染色體穩定性有關[8]。自噬是機體細胞為適應低氧、饑餓、營養奪獲和環境應激(如藥物應用)的自我保護機制，導致腫瘤抵抗治療作用，故調節自噬可以有效預防和治療腫瘤，提高腫瘤治療過程中的化療耐藥，為腫瘤治療提供新的思路[9]。在激光共聚焦顯微鏡下，觀察到Res處理組HeLa 細胞后細胞質中可見大量LC3A/B 綠色熒光分布，且熒光強度較對照組增強。LC3A/B是自噬標記蛋白，檢測細胞LC3A/B 熒光強度可作為自噬活性的標志。本研究顯示在對照組宮頸癌HeLa 細胞中LC3A/B 熒光強度較弱，明顯低于不同濃度Res治療組，表明LC3A/B 表達下調，甚至缺失存在于宮頸癌HeLa 細胞中；Res升高宮頸癌HeLa 細胞LC3表達，增強了HeLa 細胞的自噬活性或潛能。

研究[10]表明，自噬對腫瘤生長起到抑瘤作用，Beclin-1是另一種重要的自噬標記蛋白，Beclin-1基因敲除的小鼠患惡性腫瘤比野生型小鼠容易，缺失Beclin-1基因時，細胞內積累更多的異常細胞器和蛋白質；而自噬標記蛋白p62 失活會引起自噬功能障礙，DNA損傷，易引起腫瘤發生，p62 表達上升是自噬損傷的標志，饑餓、營養奪獲和環境應激等可上調p62 基因轉錄，促進從頭合成p62 蛋白[11]。本研究Western blot結果顯示，與對照組比較，Res可濃度依賴性的升高HeLa 細胞Beclin-1 表達；且Res可濃度依賴性降低HeLa細胞p62蛋白表達。表明Beclin-1、p62蛋白表達對HeLa細胞自噬活性有一定的影響，Res可以通過調節Beclin-1、p62 的表達量而影響HeLa 細胞自噬。