miR-3129通過抑制hace1促進口腔腫瘤發生的研究

胡利兵，王銀龍，朱友明

口腔癌的高發病率和死亡率已經成為嚴重影響公共健康的疾病之一，口腔癌的復發率存在逐年上升的趨勢?？谇荒[瘤由于其發生部位、組織來源和腫瘤性質復雜等特點，因此其治療手段也不盡相同。手術及放、化療等傳統治療方法可能影響面部容貌、語言功能和人類自身的免疫力等，因此迫切需要尋求更加有效的治療口腔腫瘤的方法，因此免疫治療、基因療法等新興治療方法的應用逐漸成為口腔腫瘤治療研究領域的熱點。hace1是一種腫瘤抑制基因，具有抑制腫瘤細胞生長，促使腫瘤細胞凋亡的作用。檢測hace1基因在口腔腫瘤中的表達，研究其對口腔腫瘤細胞增殖、遷移能力的影響，預測hace1的miRNA，并研究其hace1的關系，檢測miRNA-3129在口腔腫瘤中的表達，探討miR-3129和hace1是否可以作為口腔腫瘤檢測和治療的一個新靶點。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料

1.1.1細胞腫瘤細胞株scc-3來源于江蘇省藥物研究所；病毒包裝所用293T細胞由中國科學技術大學細胞生物學吳緬實驗室提供。

1.1.2菌種和載體E.colidh5α菌株由安徽醫科大學省級口腔重點實驗室保存；實驗中用于敲低hace1基因的shhace1來源于中國科學技術大學細胞生物學吳緬實驗室(購自美國Sigma公司的人和鼠的shRNA庫)。實驗用于慢病毒包裝系統的4質粒(Plko.1、VSV-G、REV、GAG )包裝系統由中國科學技術大學細胞生物學吳緬實驗室提供，這4個質粒中Plko.1為慢病毒表達載體，另外3個(VSV-G、REV、GAG)為慢病毒包裝載體。

1.1.3標本組織來源15例實驗標本取自2014年5月～2015年5月經安徽醫科大學第一附屬醫院和安徽省口腔醫院頜面外科手術切除、病理證實的涎腺病變組織，對照標本為瘤旁正常組織均來自相應患者腫瘤安全邊緣10 mm以上的組織。所有患者除口腔腫瘤病變外，并無其他明顯的全身系統性疾病，且所有患者未經放療、化療等其它手段治療。

1.1.4主要試劑DMEM培養基(高糖型)、鏈霉素和青霉素(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國HyClone公司)；質粒提取試劑盒(美國Axygen公司)；逆轉錄反應試劑盒、實時定量反應試劑盒(日本寶生物公司)；RNA抽提試劑TRIzol (上海碧云天生物技術有限公司)；噻唑藍(MTT)、聚凝胺(polybrene)、嘌呤霉素(puromycin)(美國Sigma公司)；酵母提取物、瓊脂A、蛋白胨、氯化鈉、tris、甘氨酸等(上海生物工程有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，加入鏈霉素和青霉素，置5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱內培養293T細胞和scc-3細胞株，據細胞生長情況，2～3 d傳代一次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2過表達hace1的構建及目的基因擴增Pubmed檢索人源性的hace1的CDS序列，DNAclub找出hace1CDS序列中存在的限制性酶切位點，設計出hace1基因的引物序列(F：5′-GCGAATTCATGGAGAGAGCGATGGAGCAACTC -3′，上游引物的酶切位點為EcoR Ⅰ，R：5′-GCACGCGTTTATGCCATTGTGTAACCATAGCT -3′，下游引物的酶切位點為Mlu1)，引物均由上海生物工程有限公司合成。以含有待擴增序列的DNA為模板進行PCR反應，30 μl總體積包括：上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，無菌蒸餾水12 μl，2×PfuPCRMasterMix 15 μl。在PCR擴增儀上完成PCR擴增。反應條件如下：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，共30個循環，再72 ℃延伸10 min，置4 ℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳PCR反應產物，紫外監測儀觀察電泳結果，并回收目的條帶。

1.2.3質粒的擴增和提取將設計的限制性內切酶37 ℃水浴酶切表達載體和對應DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳酶切產物并回收，并同載體在T4連接酶下連接1 h，再轉入感受態大腸桿菌dh5α，24 h后手抽酶切驗證，使含有hace1片段載體的大腸桿菌dh5α菌株通過測序獲得。

1.2.4shhace1病毒的包裝及感染在6孔板中的hek 293T細胞中轉染2 μg Plko.1空載或Plko.1-hace1、2 μg pGAG 、2 μg pREV和1 μg pVSVG，先在純DMEM培養基培養6 h，再更換含有20%胎牛血清的DMEM培養基培養24 h，含有病毒的培養基上清收集后，用0.45 μm PVDF濾頭 (Millipore)過濾上清液。scc-3細胞分別感染過濾后含有病毒的培養基上清液，同時加入 4 μg/ml polybrene (美國Sigma公司)，37 ℃孵育24 h，再更換含10%胎牛血清的DMEM培養液培養24 h,同時加入5 μg/ml puromycin 篩選細胞。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力取處于慢病毒感染的對數生長期的scc-3細胞，5×105個/每孔，6孔板中均勻接種，分正常對照組、hace1過表達組和shhace1轉染組，均勻劃出2條劃痕待24 h長至90%后，此時作為0 h時間點，hochest染色細胞，在熒光顯微鏡下0、24、48 h時分別觀察細胞遷移情況，并進行拍照、比較。

1.2.6MTT檢測細胞增殖能力按對數生長期的scc-3細胞，分為正常對照組、hace1過表達組和shhace1轉染組，96孔板按2 000個/每孔均勻接種，加入體積200 μl/每孔培養基培養，每組設3個復孔，待細胞貼壁后，按時間梯度加入藥物，加入20 μl MTT溶液(終濃度為5 g/L),37 ℃孵育4 h，吸走上清液，加入DMSO 150 μl/每孔，震蕩10 min，在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸收值，并繪制細胞生長曲線。

1.2.7實時熒光定量PCR實時熒光定量逆轉錄聚合酶連反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, QRT-PCR)檢測hace1 mRNA的表達水平，cDNA合成和總RNA提?。喝?00 mg涎腺腫瘤組織剪碎，TRIzol(日本TaKaRa公司)法獲取組織總RNA。再進行逆轉錄(試劑盒購自日本TaKaRa公司)獲得cDNA，置-20 ℃保存備用。QRT-PCR檢測hace1 mRNA 的相對表達水平，設計合成經GenBank檢索的內參β-actin的引物和hace1。擴增條件：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環。反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，在紫外燈下觀察電泳后的電泳條帶并拍照。

2　結果

2.1hace1在口腔腫瘤組織中的表達hace1作為一個腫瘤抑制基因在很多癌癥組織發現了低表達，但是其與口腔腫瘤發生發展的關系一直沒有相關報道，通過QRT-PCR方法對比分析收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的hace1 mRNA表達水平，其中12組中口腔腫瘤組織的hace1的mRNA表達水平較瘤旁正常組織低，另外3組中hace1沒有發現大的變化(圖1)。比較得出，hace1的表達水平在口腔腫瘤組織中相較正常組織呈減少趨勢，推斷hace1可能與口腔腫瘤的發生相關。

2.2hace1對口腔腫瘤細胞遷移和增殖的影響分別計數對照組和hace1過表達組的scc3細胞，轉同樣的細胞入12孔板，待細胞完全貼壁后，通過劃痕實驗檢測兩組scc-3細胞的遷移速度，結果表明當在scc3細胞中敲低hace1的表達，shhace1組細胞的遷移速度較對照組明顯加快(圖2)，實驗表明，hace1基因能抑制口腔腫瘤細胞的遷移，同樣通過MTT試驗，比較敲低對照組與hace1敲低組細胞的增殖情況顯示，當在scc3細胞中敲低hace1的表達，shhace1組細胞的增殖速度較對照組明顯加快(圖3)，矩形圖表示成功敲低了hace1的表達(圖4)，表明hace1基因能抑制口腔腫瘤細胞的增殖，以上說明抑癌基因hace1在口腔腫瘤的發展過程中起著重要的作用。

圖1　QRT-PCR法分析口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的hace1 mRNA表達水平

圖2　劃痕試驗比較敲低對照組與hace1敲低組細胞的遷移情況

2.3miR-3129調節hace1miRNA表達水平的分析hace1在口腔腫瘤中表達水平較低，是何種原因導致hace1的表達水平降低，通過生物信息學的方法，在targetscan 上對hace1的潛在miRNA進行預測顯示，miR-3129潛在靶向hace1 3′-UTR 23位

圖3　MTT試驗比較敲低對照組與hace1敲低組細胞的增殖情況

圖4　QRT-PCR檢測敲低對照組與hace1敲低組hace1 mRNA的表達水平

～30位的之間的堿基(圖5)。通過luciferase試驗證實miR-3129的確靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之間的堿基(圖6)，當在scc3細胞系中轉入miR-3129 mimics，顯示hace1的mRNA表達水平發生下調(圖7)，而在scc3細胞系中轉入miR-3129 inhibiter，顯示hace1的mRNA表達水平發生上升(圖8)，說明miR-3129通過靶向hace1 3′-UTR調控hace1的表達水平。

圖5　miR-3129潛在靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之間的堿基

圖6　luciferase試驗證實miR-3129靶向>hace1 3′-UTR23位-30位的之間的堿基

1：Psi-victor；2：Psi-hace1 3′-UTR；3：Psi-hace1 3′-UTR-mut

圖7　QRT-PCR檢測轉入miR對照或miR-3129 mimics時hace1 mRNA的表達水平

A：miR-3129的表達水平；B：hace1 mRNA的表達水平；1：miR對照；2：miR-3129 mimics

圖8　QRT-PCR檢測轉入miR對照和miR-3129 inhibiter時hace1 mRNA的表達水平

A：miR-3129的表達水平；B：hace1 mRNA的表達水平；1：miR對照；2：miR-3129 inhibiter

2.4miR-3129在口腔腫瘤組織中的表達miR-3129作為一個miRNA與腫瘤之間的關系至今鮮有報道，其在口腔腫瘤發生發展中發揮什么樣的作用，通過對收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的miR-3129進行QRT-PCR對比分析，其中12組中口腔腫瘤組織的miR-3129的mRNA表達水平較瘤旁正常組織高，另外3組中miR-3129沒有發現大的變化(圖9)。比較得出，miR-3129的表達水平在口腔腫瘤組織中相較于正常組織呈增加趨勢，且在口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織中miR-3129與hace1表達呈負相關性，推斷miR-3129可能與口腔腫瘤的發生相關。miR-3129可能通過抑制hace1促進口腔腫瘤的發生與發展。

3　討論

基因治療通過對腫瘤細胞中途變得原癌基因和抑癌基因的靶向，能有效地治療腫瘤，腫瘤基因治療著非常重要的臨床意義，其次通過了解各組織器官中那些基因的突變更易導致該部位腫瘤的發生，因此在腫瘤的診斷方面也能提供較好的依據。目前對于口腔腫瘤的原癌基因和抑癌基因主要集中于研究C-myc、ras、c-erbB(原癌基因)和p53、APC、p16、Rb(抑癌基因)等基因[1]。hace1作為一個腫瘤抑制基因與口腔腫瘤發生發展的關系一直沒有相關報道，但是已在大多數腫瘤中發現了hace1的突變和失活，提示hace1可能在口腔腫瘤的發展中也起著重要的作用。

hace1是E3泛素接酶HECT家族成員之一,其為位于6q21染色體上的潛在腫瘤抑制基因[2],其功能缺失在多種腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的作用。有研究[3]表明hace1泛素化修飾自噬受體OPTN，泛素化修飾后的OPTN能被自噬蛋白p62所識別，并形成大的自噬受體復合物，增加細胞內通過自噬途徑降解氧化損傷的蛋白量，抑制細胞增殖，該通路通過激活細胞自噬并抑制腫瘤。另有報道[4]顯示，hace1能泛素化降解Rac1抑制腫瘤的生長，在hace1表達缺失或突變的細胞中，Rac1的活性會被激活或是進一步加強，抑制了腫瘤細胞的凋亡，同時會促進腫瘤的進一步生長或發生侵潤和轉移。多項研究[5]表明hace1在多數惡性腫瘤中表達下調和突變，如在臨床乳腺癌中hace1表達缺失是最常見的突變形式，其蛋白失活在乳腺癌的發展過程中起著關鍵的作用。Sakata et al[6]分析26例腎母細胞瘤患者中發現，約77%的腫瘤樣本中幾乎檢測不到hace1的mRNA和蛋白質表達。hace1的表達水平在肝癌中表達降低，在直腸癌、肝癌和胃癌中都發現了hace1基因的甲基化，研究[7]顯示hace1基因的甲基化與腫瘤的大小，是否淋巴轉移存在直接相關性。

圖9　QRT-PCR分析口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的miR-3129 RNA表達水平

miRNA是一類內生的，由內源基因編碼的長度在18～24個短序列核苷酸的小RNA分子，miRNA使一類短鏈非編碼RNA，其不能翻譯成蛋白質，但是其在生命體中發揮著重要的調節作用，其主要通過基因轉錄后調控，影響蛋白質的正常表達發揮功能，參與到細胞分化、生長、增殖、衰老和調亡等多種生命活動[8]。研究[9]顯示 miRNA-221、miRNA-222的低表達可上調TIMP3表達，從而使乳腺癌細胞系MCF-7的增殖和遷移能力得到抑制。miRNA-27a/b可促進腫瘤血管的生成，并誘導腫瘤轉移的發生。研究[10]通過檢測485例腸癌患者中miRNA-135b的表達水平顯示，miRNA-135b在腫瘤中的表達水平較正常組織約4倍，并且miRNA-135b表達水平最高的患者存活時間最短。另有研究[11]顯示miR-34a決定了腫瘤干細胞是進行自我更新還是向分化方向發展，miR-34a通過減少Notch信號，促進細胞分化。近年來國內對于miRNA的研究也取得了重要的進步，研究[12]表明miR-621抑制fbxo11的表達，使得乳腺癌對于化療更加敏感，研究指出miR-621可作為乳腺癌潛在的治療靶標。

本次實驗對收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的hace1 mRNA表達水平進行QRT-PCR檢測，其中12組中hace1的mRNA表達水平口腔腫瘤組織較瘤旁正常組織低，另外3組中hace1未發現多大的變化。可得出，口腔腫瘤組織中hace1的表達水平相較于正常組織呈減少趨勢，推斷hace1可能與口腔腫瘤的發生相關。另外通過QRT-PCR方法對比分析收集的15組口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織的miR-3129，其中12組中miR-3129的mRNA表達水平口腔腫瘤組織較瘤旁正常組織高，其余3組中miR-3129未發現多大的變化?？傻贸?，口腔腫瘤組織中miR-3129的表達水平相較于正常組織呈增加趨勢，且miR-3129與hace1表達在口腔腫瘤組織及瘤旁正常組織中呈負相關性，推斷miR-3129可能與口腔腫瘤的發生相關。miR-3129可能通過抑制hace1促進口腔腫瘤的發生與發展。

通過生物信息學的方法預測hace1的潛在miRNA顯示，miR-3129潛在靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之間的堿基。且通過luciferase試驗得以證實，當把miR-3129 mimics轉入到scc3細胞系中，顯示 hace1的mRNA表達水平發生下調，而把miR-3129 inhibiter轉入到scc3細胞系中，顯示hace1的mRNA表達水平發生上升，說明miR-3129是通過靶向hace1 3′-UTR來調控hace1的表達水平。本課題研究顯示hace1在口腔腫瘤中低表達，并抑制口腔腫瘤的遷移去增殖，miRNA-3129可靶向hace1 3′UTR，并調節hace1表達水平，miRNA-3129在口腔腫瘤中高表達，與hace1表達成負相關性，可能通過靶向hace1促進口腔腫瘤生長，提示miR-3129和hace1可能作為口腔腫瘤檢測和治療的一個新靶點。