宮頸鱗癌中CD44分子變異體的表達分析

王　娟，宋偉國，申　震，吳大保，周　穎

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株人類宮頸癌細胞系SiHa、HeLa、ME-180細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2實驗材料反轉錄試劑盒購自北京Promega公司；PrimerSTAR PCR酶購自日本TaKaRa公司；Agarose購自合肥志宏生物公司；單克隆鼠抗人CD44v6抗體購自英國Abcam公司；CD44s抗體購自北京中杉金橋公司；ECL化學發光底物購自美國BIO-RAD公司。組織切片來自安徽省立醫院2005～2011年手術切除、并經病理診斷為宮頸鱗癌標本30例。

1.2方法

1.2.1細胞培養SiHa細胞用DMEM培養基，ME-180細胞用McCoy’s 5A培養基，加入10%胎牛血清(FCS)，青霉素10 U/ml和鏈霉素100 μg/ml,置于37 ℃、5% CO2的濕潤環境中常規培養。

1.2.2qRT-PCR用TRIzol試劑抽取 SiHa、HeLa、ME-180細胞的總RNA，取500 ng RNA 反轉成 cDNA。利用SYBR Green檢測CD44各種變異體的表達量，β-actin為內參對照。引物序列見表1。在qRT-PCR分析軟件中進行板布局，通過雙Δ法分析數據。

第四，加強前期工作，全面加快水利基礎設施建設步伐。重點水利工程前期工作取得新進展。太浦閘除險加固工程正在進行開工準備工作；加快太湖流域水資源監控與保護預警系統立項進程；新孟河、望虞河西岸控制工程、新溝河、太嘉河等工程正在加快推進。流域民生水利建設取得新發展。完成了流域片病險水庫（水閘）除險加固初步設計復核工作，完成63個縣山洪災害防治縣級非工程措施建設實施方案審核工作。直屬項目建設取得較大突破。望亭水利樞紐更新改造工程已基本完成。浙皖水環境監測中心已經完建，青浦水文巡測基地、杭州灣水文基地、水環境監測中心實驗室、太湖水行政執法基地建設全力推進。

1.2.3PCR和凝膠電泳采用圖1B位置設計CD44各種亞型引物，具體引物序列見表1。以SiHa、HeLa、ME-180 CDNA為模板，相應引物進行PCR，產物跑2%的agarose膠驗證條帶大小，切膠送擎科生物測序。

1.2.4免疫組化將獲得的宮頸鱗癌石蠟切片進行烤片、脫蠟、水化，于0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖修復液中微波加熱抗原修復，待涼至室溫，加3% H2O2溶液室溫孵育30 min,山羊血清室溫下封閉20 min,滴加1 ∶300 CD44v6、即用型CD44s單克隆抗體孵育4 h，滴加二抗室溫反應30 min,DAB顯色，蘇木精淺染細胞核，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結果。免疫組化評分標準：隨機選取至少3個視野，通過光學顯微鏡對組織切片根據著色強度評分：未著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性范圍0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，最后綜合兩部分得分相乘，再進行比較。

表1　qRT-PCR引物序列

圖1　CD44基因結構、可變剪切形式及引物設計

A:CD44不同剪切方式形成的常見亞型; B:CD44各種亞型引物設計位置

1.2.5Western blot法檢測2×loading buffer收取狀態好的SiHa、HeLa、ME-180細胞，超聲裂解，蛋白變性后經SDS-PAGE電泳，轉膜，5% BSA封閉，一抗CD44(1 ∶1 000)與actin(1 ∶1 000)過夜，TBST洗膜洗3次，加入相應的二抗孵育，洗膜ECL顯影得到CD44v6與actin蛋白表達情況。

1.3統計學處理采用SPSS 16.0和GraphPad Prism6軟件進行分析，兩樣本比較采用t檢驗，臨床樣本采用fisher精確性檢驗(樣本量小于40)。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1SiHa、HeLa、ME-180宮頸鱗癌細胞系CD44變異體表達水平qRT-PCR結果顯示，SiHa、HeLa細胞中可以檢測到CD44s、v2～v10亞型，以v6亞型為主，其次為s亞型(P<0.0001)， ME-180細胞中可以檢測到CD44s、v2～v10亞型，CD44v亞型明顯高于CD44s亞型，以CD44v6為主(P=0.003)(圖2A)。凝膠電泳結果進一步證實，SiHa、HeLa細胞系轉錄水平以CD44s、CD44v6變異體為主；ME-180細胞系主要表達CD44v型變異體，以CD446型變異體為主(圖2B)。

2.2SiHa、HeLa、ME-180宮頸鱗癌細胞系均表達CD44v6亞型鑒于子宮頸鱗癌細胞系中轉錄水平檢測到的CD44的主要亞型為v6，通過Western blot在蛋白水平檢測CD44v6亞型，結果確證了SiHa、HeLa、ME-180宮頸癌細胞系均表達CD44v6亞型，見圖3。

2.3宮頸鱗癌組織中CD44v6蛋白表達鑒于子宮頸鱗癌細胞系中轉錄及翻譯水平檢測到的CD44的主要亞型為v6，因此，對30例宮頸鱗癌組織進行免疫組化檢測其細胞定位情況，結果顯示CD44v6定位于細胞質和細胞膜，呈深淺不同的棕黃色，見圖4。

2.4CD44v6強表達與宮頸鱗癌分期、淋巴結轉移、預后的關系進一步選擇了30例宮頸鱗癌組織進行分析，結果顯示CD44v6陽性者29例(96.70%)，鑒此，根據免疫組化評分，將CD44v6表達分為強陽性(≥9分)，弱陽性(<9分)，并根據宮頸鱗癌分期、淋巴結轉移情況、預后、分化程度進行分析，結果顯示，宮頸鱗癌患者的臨床分期越晚、有淋巴結及遠處器官轉移、患者的生存期越短的癌組織中CD44v6基因表達水平越高,與分化程度無關(表2)。

圖2　qRT-PCR、凝膠電泳檢測SiHa、HeLa、ME-180宮頸癌細胞系中CD44各亞型mRNA表達水平A：qRT-PCR; B:凝膠電泳

圖3　Western blot法檢測子SiHa、HeLa、ME-180宮頸癌細胞株中的CD44v6蛋白水平

3　討論

可變剪切是指同一個基因不同外顯子以多種方式重連，形成不同的mRNA，由此產生了不同的蛋白。可變剪接參與很多重要的生命活動，包括細胞凋亡、細胞生長、血管生成、細胞運動和EMT等[6]。CD44作為擁有多種可變剪切方式的I型跨膜糖蛋白家族，近來備受關注。CD44是HA受體，主要調控細胞與細胞及ECM間的黏附作用，CD44基因經過選擇性剪切和大量轉錄后修飾形成了多種CD44變異體，不同變異體生物學功能各不相同[7-8]，如CD44s存在于大部分真核細胞中， 而CD44v主要表達于炎癥和腫瘤細胞。有研究顯示CD44各亞型通過激活STAT3[9]、Snail[10]、Wnt等信號途徑以及miR-106b[11]來調節腫瘤的侵襲和轉移,然而也有學者持相反的觀點[12]。最近研究表明,在胰腺癌[5]、胃癌[13]、乳腺癌的癌變中均有CD44s變異體轉向CD44v6，可能是因為CD44v6使存在于腫瘤細胞表面粘附因子的形態與功能發生改變，利于腫瘤細胞的擴散與轉移[14]。由于CD44各亞型在腫瘤進展的作用說法不一[5]，宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，明確宮頸癌CD44分子變異體的表達情況是判斷CD44各亞型功能的前提。

圖4　免疫組化檢測宮頸癌組織中CD44v6蛋白的表達水平及部位

因素nCD44v6表達+-P值CD44v6表達強陽性≥9分<9分P值分期 ≤Ⅱ期18171810 >Ⅱ期121200.6001110.010分化程度 高、中1716198 低131300.5671030.167淋巴結轉移 無232211211 有7700.767700.025生存期 ≥5年212011011 <5年9900.700900.012

本研究表明，在宮頸鱗癌細胞系SiHa、HeLa、ME-180中CD44各亞型表達情況并非相同，在 SiHa和HeLa是以CD44s和CD44v6變異體為主，而ME-180CD44v型明顯高于CD44s型，以CD44v6為主。多篇文章報道可變剪切涉及各種生物過程，包括細胞循環、能量運輸、生長發育和信號轉導，可變剪切失調導致人類疾病包括癌癥[15]。更有報道[13]表明癌變中有CD44s變異體轉向CD44v6。在宮頸癌細胞系存在明顯的可變剪切形式的不同，這種不同是否導致腫瘤的擴散及轉移仍需進一步闡釋，需要進一步深入討論。值得注意的是，CD44v6在這三種宮頸鱗癌細胞系均有很高的表達，并通過宮頸鱗癌組織中也同樣證實了這點，免疫組化結果顯示CD44主要位于宮頸癌細胞膜和細胞質，是一個多結構多功能的跨膜糖蛋白，與選擇素、整合素和鈣黏蛋白一起構成巨大的CAMs，而CAM通過介導細胞間或細胞與基質間的黏附來調控組織的完整性，故其表達部位可能與腫瘤的侵襲轉移相關。30例宮頸癌組織CD44v6表達率高達96.70%，且本研究結果顯示，CD44v6蛋白表達水平與腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移受累、不良預后正相關。提示CD44v6在宮頸鱗癌的發生發展中可能發揮了重要的作用，可能作為宮頸鱗癌預后的指標。

參考文獻