乙酰唑胺對IL-1β誘導的大鼠關節軟骨細胞凋亡的影響及機制研究

陳偉娜，李春梅，朱仲珍，蔡　莉，李　榮

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫性疾病,主要以慢性滑膜炎癥、軟骨和骨質破壞為特征。RA關節軟骨細胞功能異常，喪失了合成、修復軟骨基質的能力而導致軟骨損傷，軟骨損傷與RA嚴重程度和預后密切相關，保護軟骨功能可以有效降低RA致殘率[1]。迄今為止，水通道蛋白(aquaporins, AQPs)已在哺乳動物中鑒定和克隆出13種AQPs (AQP0～12)亞型，顧名思義，都是與水通透性相關的膜蛋白。研究[2-4]表明AQP1在RA疾病進展中發揮重要作用：AQP1在RA患者滑膜和關節軟骨組織中均表達升高，AQP1能調節軟骨細胞體積和基質合成，與RA軟骨損傷、關節積液、滑膜炎癥和關節腫脹等密切相關，調控AQP1的表達和功能可能是RA的潛在治療靶點。該研究使用炎癥因子白介素(intertleukin，IL)-1β誘導大鼠關節軟骨細胞致其損傷作為軟骨細胞凋亡的體外模型，觀察AQP1抑制劑乙酰唑胺(acetazolamide, AZ)對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響，并從影響凋亡相關基因表達和NF-κB通路探討其可能機制，為防治RA尤其是保護RA關節軟骨提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物Sprague-Dawley大鼠(安徽醫科大學實驗動物中心)，清潔級，雄性，2～3周齡，100～120 g。

1.2藥物與試劑AZ、Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)；IL-1β(美國PeproTech公司)；Rhodamine-123(北京索萊寶科技公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；MTT、Hoechst 33258 染色液(上海碧云天生物技術研究所)；所有抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.3軟骨細胞的分離培養與鑒定參考文獻[5]方法，分離大鼠膝關節表面軟骨，37 ℃下胰酶和0.2% Ⅱ型膠原酶分別消化30 min和3 h；200目濾網過濾,1 500 r/min離心10 min，PBS清洗，收集細胞；加入含10%胎牛血清的DMEM吹打均勻后移入培養瓶，培養48 h，換液，除去未貼壁細胞，當原代培養的細胞連成片時進行消化傳代。本實驗中所用細胞為傳1～3代的關節軟骨細胞，采用光鏡下觀察細胞形態、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色和蛋白多糖甲苯胺藍染色等進行軟骨細胞的鑒定。

1.4MTT法檢測細胞增殖收集大鼠關節軟骨細胞，制成單細胞懸液，接種于96孔板(密度5×108/L)，分為6組：正常組，IL-1β誘導組(終濃度10 mg/L，濃度參考文獻[6])，AZ體外給藥組(終濃度分別為12.5、25、50、100 μmol/L)。每孔100 μl，37 ℃、5% CO2培養48 h貼壁，棄去培養液。正常組不做處理，僅加入DMEM培養液培養44 h，IL-1β誘導組加入含IL-1β的DMEM培養液培養44 h，各給藥組加入含IL-1β和不同濃度AZ的DMEM培養液培養44 h，每孔細胞均加入 10 μl MTT(5 g/L)繼續孵育4 h后，再加入150 μl DMSO溶解細胞內結晶，室溫振蕩溶解，用酶標儀在570 nm測定吸光度值(即A570值)。

1.5Hoechst33258染色觀察細胞凋亡將關節軟骨細胞以2×108/L的細胞密度接種于6孔板(孔內預置無菌爬片)，分為正常組、IL-1β誘導組和3組AZ給藥組(12.5、25、50 μmol/L)，每孔2 ml細胞懸液，培養48 h后棄去培養液，IL-1β組加入含IL-1β的培養基培養24 h，各給藥組加入含10 mg/L IL-1β和不同濃度AZ的培養液培養24 h，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1% TritonX通透，滴加Hoechst 33258染液(10 mg/L)避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率各組細胞經相應處理后，吸取上清液至離心管，貼壁細胞用胰酶消化后將細胞轉入對應離心管，離心，收集細胞，PBS洗滌，加入400 μl Annexin V結合液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，4 ℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液4 ℃孵育5 min，流式細胞儀檢測，采用WinMDI軟件進行分析。

1.7Rhodamine-123染色觀察細胞凋亡按前述方法進行細胞爬片和藥物處理，PBS洗滌，加入含Rhodamine-123(終濃度10 μmol/L)的DMEM培養液，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。選取5個不同的視野，用ImageJ圖片分析軟件對各視野平均熒光強度進行分析統計。

1.8Westernblot檢測相關蛋白① 各組細胞經相應處理后，加入400 μl含磷酸酶抑制劑及PMSF的裂解液，在冰上振動裂解約20～30 min；② 裂解結束后，利用刮棒將細胞刮至一側，將細胞碎片移至1.5 ml離心管中，先渦旋10次再12 000 r/min離心取上清液于新的EP管中；③ 取適量上清液加入蛋白上樣緩沖液(4 ∶1)，搖勻，100 ℃煮沸10 min，冷卻待用；④ SDS-PAGE電泳分離樣品，轉膜(PVDF膜)，配置5%脫脂牛奶封閉3 h，加入一抗孵育過夜(4 ℃)，二抗孵育1 h；⑤ 使用ECL發光試劑盒在顯影儀中顯影，采用ImageJ圖片分析軟件對蛋白條帶灰度值進行分析處理。

2　結果

2.1軟骨細胞的鑒定主要通過觀察細胞形態變化、蛋白多糖及Ⅱ型膠原的表達，進行關節軟骨細胞的鑒定。如圖1A所示，傳1代的細胞形態以梭形為主，細胞質豐富，細胞周圍可見具有折光性的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色鑒定顯示：軟骨細胞胞質被染成棕色，密集生長處染色較深，表明Ⅱ型膠原存在表達(圖1B)。甲苯胺藍染色結果顯示：細胞質被染成淺藍色，胞核被染成深藍色，有時可見雙核，表明存在蛋白多糖的表達(圖1C)。上述實驗結果表明培養的細胞與關節軟骨細胞特征一致。

圖1　大鼠關節軟骨細胞的培養和鑒定　×200

2.2AZ對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖的影響MTT法檢測AZ體外對IL-1β誘導的關節軟骨細胞增殖的影響。如圖2所示，IL-1β誘導組軟骨細胞的增殖反應明顯低于正常組(F=14.03，P<0.01)，與IL-1β誘導組相比，AZ(12.5、25、50、100 μmol/L)體外給藥能不同程度地提高IL-1β誘導的軟骨細胞增殖反應，其中25、50和100 μmol/L差異有統計學意義，考慮到50 μmol/L AZ的作用優于100 μmol/L，且AZ在12.5～50 μmol /L表現出劑量依賴性(r=0.731，P<0.01)，因此選擇12.5、25和50 μmol/L 3個AZ濃度進行下一步研究。

2.3Hoechst33258染色觀察AZ抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡Hoechst 33258作為一種特異性DNA染料，通過其染色熒光強度能反應細胞凋亡情況。如圖3所示，正常組軟骨細胞的細胞核多數呈現均勻的藍色熒光；IL-1β誘導組軟骨細胞可見較多的染色質固縮、聚集和核碎裂，呈現出典型凋亡形態學改變，表明IL-1β誘導組軟骨細胞存在異常凋亡過程；AZ體外給藥組僅有少量的軟骨細胞出現凋亡形態學改變，提示AZ對IL-1β誘導的軟骨細胞具有抗凋亡作用。

2.4AnnexinV-FITC/PI雙染檢測AZ抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡如圖4所示，在雙變量散點圖上，FITC-/PI+(左上象限)表示死細胞，FITC+/PI+(右上象限)表示中晚期凋亡細胞，FITC-/PI-(左下象限)表示活細胞，FITC+/PI-(右下象限)表示早期凋亡細胞，右上和右下象限的細胞占全部細胞的比例代表細胞凋亡率(%)，定量分析結果表明，與正常組(9.20±0.94)%相比，IL-1β誘導組關節軟骨細胞的凋亡率(33.18±3.06)%明顯增高(F=34.19，P<0.01)，AZ(12.5、25、50 μmol/L)能劑量依賴性地降低IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡率(r=-0.855，P<0.01)，其中AZ(25、50 μmol/L)的差異有統計學意義。

圖2　AZ對IL-1β誘導的關節軟骨細胞增殖的影響

1：正常組；2：IL-1β誘導組；3：AZ 12.5 μmol/L；4：AZ 25 μmol/L；5：AZ 50 μmol/L；6：AZ 100 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3　Hoechst 33258 染色觀察AZ抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡　×100

圖4　Annexin-V FITC/PI 雙染檢測AZ抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡

A：正常組；B：IL-1β誘導組；C：AZ 12.5 μmol/L；D：AZ 25 μmol/L；E：AZ 50 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5Rhodamine-123染色檢測AZ抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡線粒體能夠在細胞凋亡過程中起樞紐作用，其膜電位的下降是凋亡級聯反應中最早期事件。Rhodamine-123作為親脂性陽離子熒光染料在結合到線粒體基質后，其熒光的變化說明線粒體內膜電負性的相應改變。如圖5所示，正常組軟骨細胞線粒體染色分布均勻，熒光強度強；IL-1β誘導組軟骨細胞線粒體對Rhodamine-123的攝取能力降低，熒光強度弱；半定量分析結果表明，與IL-1β誘導組相比，不同劑量AZ處理組軟骨細胞的熒光強度有不同程度的提高(F=37.41，P<0.01)，其中AZ(25、50 μmol/L)差異有統計學意義。

2.6AZ對IL-1β誘導的軟骨細胞中AQP1和凋亡相關基因蛋白表達的影響Western blot法檢測AQP1、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白表達并進行統計學分析(圖6)。IL-1β組軟骨細胞中AQP1蛋白表達增高，AZ體外給藥可以抑制AQP1蛋白表達(F=11.99，P<0.01)；同時，與正常組比較，IL-1β組的Bcl-2蛋白表達顯著下降(F=30.10，P<0.01)，而Bax和Caspase3 蛋白表達明顯升高(F=50.13、167.88，P<0.01)，與IL-1β組比較，AZ體外能夠提高Bcl-2蛋白表達，并且降低Bax和Caspase3蛋白表達，這可能與AZ抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的作用密切相關。

2.7AZ對IL-1β誘導的軟骨細胞中NF-κB信號通路的影響Western blot法檢測NF-κB信號通路相關蛋白表達并進行統計學分析(圖7)。與正常組比較，IL-1β組IκB蛋白表達下降(F=172.03，P<0.01)，而p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達增加(F=56.19、61.84，P<0.01)，與IL-1β組比較，AZ體外可以有效抑制IκBα的降解和磷酸化，并顯著減少p-NF-κB p65蛋白表達，而各組細胞中NF-κB p65的蛋白表達水平無明顯改變(F=0.49，P>0.01)，表明AZ體外給藥降低IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡可能通過抑制NF-κB信號通路的活化實現。

圖5　Rhodamine-123染色檢測AZ抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡　×100

圖6　AZ對IL-1β誘導的軟骨細胞中AQP1和凋亡相關基因蛋白表達的影響

A：各組細胞中AQP1、Bcl-2、Bax和Caspase3蛋白表達的典型條帶圖；B：蛋白表達的半定量分析統計圖；1：正常組；2：IL-1β誘導組；3：AZ 12.5 μmol/L；4：AZ 25 μmol/L；5：AZ 50 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖7　AZ對IL-1β誘導的軟骨細胞中NF-κB信號通路的影響

A：各組細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達典型條帶圖；B：蛋白表達的半定量分析統計圖；1：正常組；2：IL-1β誘導組；3：AZ 12.5 μmol/L；4：AZ 25 μmol/L；5：AZ 50 μmol/L；與正常組比較：##P<0.01；與IL-1β誘導組比較：*P<0.05，**P<0.01

3　討論

軟骨細胞作為關節軟骨中的唯一細胞類型，維持軟骨組織乃至關節的內環境穩定。RA患者關節軟骨細胞存在過度凋亡，引發關節軟骨ECM迅速而廣泛的損失，抑制軟骨細胞凋亡有望成為RA治療的新方法[7-9]。在RA患者滑液和血清中IL-1β是最重要的促炎細胞因子，其通過參與抑制Ⅱ型膠原、蛋白多糖的合成以及誘導軟骨細胞的凋亡、刺激基質金屬蛋白酶的產生從而導致軟骨ECM降解誘發關節軟骨損傷。現今，IL-1β誘導建立關節軟骨細胞的凋亡模型已被廣泛應用[6,10]。所以本研究以IL-1β誘導分離培養的大鼠關節軟骨細胞使其凋亡，觀察AZ體外對IL-1β誘導的關節軟骨細胞凋亡的影響，并探討其可能機制。

大量研究表明，碳酸苷酶抑制劑AZ可以顯著降低AQP1介導的水通透性[11]，并能夠直接抑制AQP1的表達進而發揮抑制腫瘤轉移和血管生成的能力[12]，故AZ可以作為合適的AQP1抑制劑，與既往報道一致；本研究顯示AZ體外給藥能夠有效抑制IL-1β誘導組軟骨細胞中AQP1蛋白表達。參考既往文獻中AZ的體外給藥劑量，本研究采用MTT法觀察了AZ(12.5、25、50、100 μmol/L)對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖的影響，結果顯示AZ在12.5～50 μmol/L濃度范圍內能劑量依賴性地提高IL-1β誘導的軟骨細胞增殖反應。Hoechst 33258染色結果表明，IL-1β組軟骨細胞呈現出典型的凋亡形態學改變如染色質固縮和核碎裂，而AZ組多數細胞呈現均勻藍色熒光，凋亡細胞數相對減少。Annexin-V FITC/PI雙染法結果表明，與正常組相比，IL-1β誘導組的細胞凋亡率顯著增高，AZ體外給藥可以劑量依賴性地降低IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡率。Rhodamine-123染色結果表明，IL-1β誘導組軟骨細胞的熒光強度弱，不同劑量AZ處理組軟骨細胞的熒光強度有不同程度的提高。上述結果提示IL-1β誘導的關節軟骨細胞存在明顯的細胞凋亡過程，AZ體外能夠有效抑制其過度凋亡。

細胞凋亡是一種為維持內環境穩定的細胞自主性死亡，多種癌基因和抑癌基因都參與了對凋亡的調控。Bcl-2基因家族中的Bcl-2和Bax是細胞凋亡的重要調節因子，Bax介導線粒體細胞色素C的釋放促進細胞凋亡，而Bcl-2與促凋亡蛋白形成異源二聚物抑制細胞凋亡[13]。作為級聯反應中的關鍵蛋白酶，Caspase3調控各條凋亡通路，是凋亡的最終執行者，抑制Caspase3活性或功能可減少細胞凋亡[14]。文獻[7,15]報道指出RA軟骨組織中Bcl-2蛋白表達降低，Caspase3蛋白表達升高，與RA關節軟骨細胞的異常凋亡過程密切相關。在本研究中，IL-1β誘導組中Bcl-2(抗凋亡基因)蛋白表達顯著下調，而Bax和Caspase3(促凋亡基因)蛋白表達明顯升高，AZ體外可以上調Bcl-2表達、下調Bax和Caspase3表達，表明AZ能夠通過調控凋亡相關基因的表達進而發揮其抗凋亡作用。

NF-κB信號通路異常活化在RA的發生和發展過程中發揮重要作用，參與RA滑膜炎癥和關節軟骨損傷[16]。在靜息狀態時，胞質中的NF-κB p65與IκB結合形成無活性的二聚體；在應激狀態時，IκB磷酸化并迅速降解，NF-κB p65與IκB分離，活化的NF-κB p65進入細胞核，導致眾多促炎介質的產生。與既往文獻[10]報道一致，IL-1β誘導組軟骨細胞存在NF-κB信號通路的過度活化，表現為IκB蛋白表達下降，而p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達增加。余涵 等[17]報道AZ體內給藥可以抑制慢性癲癇大鼠海馬組織中NF-κB信號通路的活化，與之相似，在本研究中，AZ體外給藥可以提高IκB蛋白的表達水平，降低p-IκBα和p-NF-κB p65的蛋白表達水平，提示AZ可以抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞NF-κB信號通路活化，可能與其抗凋亡作用密切相關。