CRAE對百草枯中毒大鼠肺纖維化的保護作用機制

郭啟芬，謝來柱，張　泓

隨著百草枯(paraquat)在農業中廣泛應用，百草枯中毒事件越來越多，而百草枯中毒的患者往往會繼發性肺纖維化從而引起限制性肺通氣障礙。現代醫學認為，肺纖維化一種以肺間質炎癥、纖維組織增生、胞外基質代謝異常的彌漫性肺間質疾病[1]。本病的平均生存期不高，且臨床上缺乏有效的治療手段。中醫治療肺部疾病已有數千年歷史，有豐富的經驗和理論基礎。該課題組根據當地治療“肺疾”偏方，結合傳統中醫理論及西醫肺纖維化相關的基礎研究，使用現代水提法制備出復方赤芍黃芪提取物(compound of Radix Paeoniae Rubra and Astragalus extract,CRAE)，并觀察其對百草枯引起的肺纖維化等方面的療效。

1　材料與方法

1.1藥物制備復方赤芍黃芪提取物是根據當地治療“肺疾”偏方和單劑藥物成分修正，以赤芍、黃芪、鱉甲以及其他輔料按照(2 ∶2 ∶1 ∶1)配伍，使用現代水提法工藝制備而成。其主要成分有芍藥苷、芍藥內脂苷、黃芪多糖、鱉甲多糖等。

1.2實驗試劑轉化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β1) ELISA試劑盒、Ⅰ型纖溶酶原激活抑制因子 (plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1) ELISA試劑盒、金屬基質蛋白酶9 (matrix metallopeptidase 9,MMP-9) ELISA試劑盒、基質金屬蛋白酶抑制劑1 (tissue inhibitor of metallopeptidase 1,TIMP-1) ELISA試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)試劑盒、透明質酸(hyaluronic acid,HA)試劑盒、Ⅲ 型膠原蛋白(collagen protein type Ⅲ ,PC-Ⅲ )試劑盒、層粘連蛋白(laminin,LN)試劑盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α) ELISA試劑盒、白介素17(interleukin 17,IL-17) ELISA試劑盒、白介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA試劑盒、BCA法蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；P-Smad2、Smad2、P-Smad3、Smad3、Smad7、GAPDH、PAI-1一抗及二抗購自美國Sigma公司；qPCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；PAI-1引物購自上海生工生物公司。

1.3實驗動物及分組選用雄性SD大鼠90只，體重260 g左右，由安徽醫科大學動物實驗中心提供，許可證號2008003。將動物飼養于恒溫無菌動物房中，隨機分成6組，每組15只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組(潑尼松5.0 mg/kg)、CRAE 0.6 g/kg組、CRAE 1.2 g/kg組、CRAE 2.4 g/kg組。

1.4實驗動物造模[2]將模型組、陽性對照組、CRAE 0.6 g/kg組、CRAE 1.2 g/kg組、CRAE 2.4 g/kg組大鼠稱重后按照0.1 ml/100 g百草枯藥液灌胃造模。造模結束24 h后，按照相應給藥方式進行灌胃處理，每天1次。造模后各組大鼠均出現呼吸變淺、呼吸頻率加快、呼吸困難等癥狀。實驗進行至4周時，有大鼠開始死亡，結束灌胃并處死大鼠。摘取大鼠肺臟稱重并計算肺臟臟器指數。肺臟臟器指數=肺臟重量/大鼠體重。腹主動脈取血，以1 000 r/min離心20 min分離血清后置于-20 ℃冷凍備用。取大鼠肺臟并使用組織均漿機均漿組織液，置于-80 ℃冷凍備用。

1.5大鼠血清HA、PC-Ⅲ、LN含量和肺組織中MMP-9、TIMP-1、Hyp、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-17、IL-6、TGF-β1、PAI-1含量測定取出凍存的大鼠血清和組織液，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量和肺組織中MMP-9、TIMP-1、Hyp、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-17、IL-6、TGF-β1、PAI-1含量。

1.6Q-PCR法檢測PAI-1mRNA的含量使用TRIzol試劑盒提取大鼠組織液中的總RNA。使用qPCR試劑盒檢測各組PAI-1的mRNA含量。以GAPDH作為標準校準。使用的qPCR引物見表1。

表1　PCR所用引物及其序列

1.7Westernblot法分析P-Smad2、Smad2、P-Smad3、Smad3、Smad7和PAI-1蛋白的含量將凍存的肺組織液與RIPA組織裂解液混合后，4 ℃冰上靜置30 min，4 ℃、13 000 r/min離心30 min，離心結束后取上清液。使用BCA法測定各組蛋白濃度，按照Western blot法將蛋白變性、電泳、轉膜后置于4 ℃一抗雜交袋過夜，TBST清洗后，室溫孵育二抗2 h。使用ECL發光試劑盒進行曝光并分析統計。

2　結果

2.1CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠存活率、肺臟重量和肺臟臟器指數的影響與正常對照組相比，模型組大鼠的肺臟重量和肺臟臟器指數明顯升高(P<0.05)，存活率明顯降低；與模型組相比，陽性對照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺纖維化大鼠的肺臟重量和肺臟臟器指數，升高大鼠的存活率，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量的影響與正常對照組相比，模型組大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺纖維化大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN的含量，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠肺組織中MDA、SOD和GSH-Px含量的影響與正常對照組相比，肺纖維化大鼠肺組織中MDA的含量明顯升高，SOD和GSH-Px的含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組大鼠肺組織中MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px的含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2　CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠存活率、肺臟重量、肺臟臟器指數和血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量的影響

與正常對照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

表3　CRAE對百草枯誘導肺纖維化模型大鼠肺組織中MDA、SOD、GSH-Px、MMP-9、TIMP-1和Hyp含量的影響

與正常對照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

表4　CRAE對百草枯誘導肺纖維化模型大鼠肺組織TNF-α、IL-17、IL-6 、TGF-β1和PAI-1的影響

與正常對照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

2.4CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1和Hyp含量的影響與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織中MMP-9的含量明顯降低，TIMP-1和Hyp含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組大鼠肺組織中MMP-9的含量明顯升高，而TIMP-1和Hyp的含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.5CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠肺組織中TNF-α、IL-17和IL-6含量的影響與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織中TNF-α、IL-17和IL-6的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組TNF-α、IL-17和IL-6的含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

2.6CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1含量的影響與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1的含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

2.7CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠肺組織中P-Smad2、P-Smad3和Smad7蛋白水平的影響與正常對照組相比，模型組肺纖維化大鼠肺組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白的表達水平顯著升高，Smad7蛋白的表達水平降低(P<0.05)；與模型組相比，CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組能明顯降低大鼠肺組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白水平，升高Smad7蛋白水平，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.8CRAE對百草枯誘導的肺纖維化大鼠肺組織中PAI-1及mRNA水平的影響與正常對照組相比，模型組肺纖維化模型大鼠肺組織中PAI-1蛋白及mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組肺纖維化大鼠肺組織中PAI-1蛋白及mRNA的水平明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

3　討論

百草枯中毒后絕大部分集中在肺組織，引起肺泡損傷以及炎細胞浸潤，最終導致肺泡內及間質纖維化，影響氣體交換，死亡率高，且存活者中大部分存在肺纖維化。因此，有效干預及減輕肺損傷及繼發肺纖維化可以減少百草枯中毒的病死率。現代醫學關于肺纖維化研究顯示，許多細胞因子，如TNF-α、IL-17、IL-6、PDGF、TGF-β，通過自分泌或旁分泌形式啟動細胞內級聯信號轉導，調控相應基因表達，從而導致肺纖維化的發生。其中，TGF-β1在肺纖維化病理過程中起重要作用。有研究[3]表明，TGF-β1基因表達廣泛表達于肺損傷至肺纖維化各個階段，在趨化巨噬細胞和成纖維細胞，誘導相關炎癥因子釋放，促進成纖維細胞增生，增加胞外ECM沉積等方面均有重要的作用。在本研究中，CRAE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺臟重量和肺臟臟器指數，降低TGF-β1在肺組織中的含量，提示CRAE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組對肺纖維化有一定的療效。

圖1　CRAE對百草枯誘導的肺纖維化模型中大鼠肺組織中P-Smad2、P-Smad3和Smad7蛋白水平的影響

A：P-Smad2；B：P-Smad3；C：Smad7；1：正常對照組; 2：模型組; 3：CRAE 1.2 g/kg組; 4：CRAE 2.4 g/kg組；與正常對照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

圖2　CRAE對百草枯誘導的肺纖維化模型中大鼠肺組織中PAI-1蛋白和mRNA水平的影響

1：正常對照組; 2：模型組; 3：CRAE 1.2 g/kg組; 4：CRAE 1.4 g/kg組；與正常對照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

百草枯中毒后，機體產生活性氧自由基和活性氮自由基可導致生物大分子發生脂質過氧化，從而引起細胞和組織損傷。MDA作為脂質過氧化產物之一，是判斷細胞受損的重要標志物。SOD和GSH-Px可清除體內產生的自由基，減輕和阻斷脂質過氧化物對機體的損害，保護機體免受各類自由基的損害[4]。在本次實驗中，模型組大鼠的MDA顯著升高，而SOD和GSH-Px含量顯著下降，提示百草枯可引起大鼠產生自由基損害肺泡細胞，而CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺組織中MDA含量，升高SOD和GSH-Px的水平，提示CARE可以保護肺臟對抗百草枯中毒引起氧化應激反應。在肺纖維化發生的過程中，細胞外ECM降解與重塑失衡。MMP-9可以降解肺ECM和基底膜，并能調節其他細胞因子及細胞，從而抑制肺纖維化的發生發展，而TIMP-1可特異性抑制MMP-9的降解作用。MMP-9和TIMP-1作為影響ECM代謝的主要酶類，在肺纖維化過程中對ECM平衡起著關鍵作用[5]。HA、PC-Ⅲ、LN、Hyp等可反應肺纖維化形成，膠原增生和肺臟纖維化程度，是肺纖維化活動性的指標[6]。在本次研究中，CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以升高模型大鼠肺組織中MMP-9的含量，抑制TIMP-1的水平，提示CARE可以調控肺纖維化的胞外ECM失衡；進一步的， CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以降低模型大鼠肺組織中的HA、PC-Ⅲ、LN、Hyp含量，提示CARE可以抑制胞外ECM的堆積，抑制大鼠的肺纖維化的生成。

在肺纖維化的發生過程中，大量的細胞因子如TNF-α、IL-17、IL-6等也發揮了重要的作用。TNF-α參與肺臟損傷，引起大量膠原合成和沉積，IL-17和IL-6是細胞炎性因子，介導肺臟炎癥反應，導致肺纖維化[7]。在不同結構的TGF-β中，TGF-β1表達最久，作用最重要，其高低直接影響肺纖維化的程度。其信號主要是通過TGF-β跨膜受體(TGF-β receptor R,TGF-βR)及胞內Smad信號通路介導。當TGF-β1與TGF-βR結合后，可磷酸化胞內的Smad2和Smad3蛋白，繼而與Smad4結合形成復合物(P-Smad2/3/4)，轉位入核調節相應靶基因的表達。Smad7可與TGF- TGF-βRⅡ結合，抑制Smad2/3磷酸化，從而抑制TGF-β/Smad通路[8-9]。PAI-1是TGF-β1重要的靶基因，作為纖溶酶原激活物抑制劑，能通過抑制纖溶酶的生成，增加細胞外基質的沉積[10]。在本次實驗中， CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以顯著降低模型大鼠肺組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白水平，升高Smad7的水平；而且CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組還可以升高PAI-1蛋白和mRNA水平。以上結果提示CARE可以通過抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2和Smad3的磷酸化水平，提高Smad7蛋白，降低PAI-1的表達，抑制肺纖維化的發生。

綜上所述，CARE對百草枯引起的肺纖維化有一定的保護作用，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad通路，上調Smad7表達，降低PAI-1表達等有關。