內皮祖細胞條件培養基對脂肪干細胞成骨分化的影響

曹　樂，方　曉，丁振飛，王　濤，黃　威，饒先亮，尹宗生

脂肪間充質干細胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells，ADSCs)具有較強的增殖能力和多向分化潛能，能夠滿足組織工程對細胞數量和種類的要求，因而被認為比較可靠的應用于骨組織工程的種子細胞來源[1]。但單一的干細胞移植往往因干細胞生存所需微環境在體內難以完全復制，結果導致移植效率較低。雖然人們早已認識到血管化在骨形成和修復中的重要作用，但是成血管細胞能否促進骨再生及其機制尚未完全明了。該研究通過特定的條件培養基培養種子細胞來部分模擬體內多細胞之間相互作用的環境，從而在細胞水平探討具有成血管潛能的內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)通過間接接觸對具有成骨潛能的ADSCs的增殖和成骨能力的生物學影響，為闡明血管化與骨形成之間的生物耦聯機制提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物80～100 g SPF級雌性SD 大鼠2只； 200～220 g SPF 級雌性SD大鼠4只，均購自安徽省實驗動物中心。

1.3大鼠骨髓源EPCs的分離與培養取1只80～100 g SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后使用75% 酒精浸泡15 min，于超凈工作臺中分離大鼠下肢。剪去大鼠股骨及脛骨骨骺端，吸取F液(大鼠骨髓淋巴細胞分離液試劑盒)反復沖洗髓腔，沖出骨髓置于60 mm培養皿中吹打均勻，1 550 r/min 離心5 min后棄上清液，使用5 ml組織液(大鼠骨髓淋巴細胞分離液試劑盒)將上述骨髓組織重懸備用。將上述備用的組織液重懸的骨髓細胞緩慢加入5 ml淋巴細胞分離液上層，1 550 r/min離心20 min，可見骨髓細胞分層排列于淋巴細胞分離液中，小心吸取其中白色絮狀單核細胞層，使用EBM-2培養基重懸清洗2遍后，接種于預先包被纖維黏連蛋白(FN)(20 μg/ml)的6孔板中，放入恒溫細胞培養箱內培養，48 h后全量換液，以后每2 d半量換液1次。原代培養的EPCs融合成片后按1 ∶2傳代。

1.4大鼠ADSCs的分離與培養參考文獻[2]方法，取1只200～220 g SD大鼠， 10%水合氯醛麻醉后使用75% 酒精浸泡15 min，于超凈工作臺中分離大鼠腹股溝皮下脂肪，使用含1%雙抗的PBS清洗3次。將脂肪組織剪碎后加入雙倍體積的 0.1% Ⅰ型膠原酶溶液，混合均勻。將密封的離心管置于 37 ℃恒溫水浴鍋中緩慢震蕩消化60 min后，1 200 r/min離心20 min，去除上層油脂、未消化的脂肪組織及纖維結締組織等。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)重懸細胞，200 μm濾網過濾后，以1 200 r/min離心10 min，去除上層液面漂浮的油脂，重復上述步驟至去凈懸浮油脂。使用含10%胎牛血清(fetal calf serum，FBS)的LG-DMEM 重懸細胞，接種于 T25培養瓶中，置于恒溫細胞培養箱中培養，以后每3 d換液1次。原代培養的細胞融合成片后按1 ∶3的比例傳代培養。 CCK-8法測量ADSCs生長曲線。

1.5免疫熒光檢測ADSCs和EPCs表面標志物調整第3代ADSCs和第2代EPCs濃度為3×105/ml，按每孔0.5 ml接種于預先鋪好細胞爬片的24孔板中。待細胞貼壁后移除培養基，4%多聚甲醛固定后PBS浸洗3次，山羊血清封閉30 min。于ADSCs爬片上滴加稀釋好的兔抗大鼠CD90一抗，EPCs爬片加入稀釋好的兔抗大鼠CD133、VEGFR-2一抗，放入濕盒，4 ℃孵育過夜。第2天，PBST浸洗爬片3次后吸干爬片上多余液體，滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20～37 ℃孵育1 h后，PBST浸洗爬片3次。滴加DAPI后避光孵育5 min后，對上述細胞爬片進行核染，PBST洗去多余的DAPI后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.6ADSCs和EPCs的功能鑒定

1.6.1ADSCs成軟骨誘導分化第3代ADSCs生長80%～90%融合后，使用成軟骨誘導分化培養基培養3周，甲苯胺藍染色后鏡下觀察，以細胞被甲苯胺藍染成藍色為陽性結果。

1.6.2ADSCs成骨誘導分化第3代ADSCs生長至80%～90%融合時，用成骨誘導分化培養基培養3周，茜素紅染色后鏡下觀察，以細胞基質被茜素紅染成紅色為陽性結果。

1.6.3ADSCs成脂誘導分化第3代ADSCs生長至100%融合或者過融合后，使用成脂誘導分化培養基A液培養3 d ，誘導3 d 后換為成脂誘導培養基B液，A液和B液交替作用3～5次。油紅O染色后鏡下觀察，以ADSCs 胞質中可見有大小不等紅染的脂滴形成為陽性結果。

1.6.4EPCs體外成血管能力參考文獻[3-4]方法，取96孔板，按每孔50 μl鋪被基底膠于皿底，胰酶消化第2代EPCs，制備濃度為2×104/ml的EPC細胞懸液接種于各孔，輕輕振蕩均勻，培養箱中孵育12 h。倒置顯微鏡觀察，以能形成管腔樣結構為陽性結果。

1.6.5EPCs吞噬功能參考文獻[4]方法，取融合度達80%的第2代EPCs，加入4 μg/ml的Dil-acLDL，培養箱中孵育4 h。PBS洗3次后多聚甲醛固定15 min，加入10 mg/L的FITC-UEA-1，孵育1 h。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。 Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPCs。

1.7制備內皮祖細胞條件培養基(EPC-CM)取經過鑒定的原代培養后1～2代的EPCs, 以每孔1×105個細胞接種至6孔板中，待細胞達到80%～90%融合后，換用不含FBS的LG-DMEM，于1%氧濃度培養48 h后收集舊培養基，3 000 r/min離心10 min，取上清液即為EPC條件培養基。重復制備，直至足量。經0.22 μm濾膜過濾后，貯存于-80 ℃ 冰箱中備用。

1.8CCK-8法檢測不同濃度EPC-CM培養的ADSCs增殖活性取第2代ADSCs，用含10% FBS的LG-DMEM培養基制備細胞懸液，調整細胞密度為 2×104/ml，按每孔100 μl接種于96孔培養板內，培養24 h后，吸除原培養基后，以含1%的FBS生長培養基饑餓處理24 h后，加入含1%FBS的不同濃度EPC-CM 100 μl，分別為對照組(使用LG-DMEM培養)、50%EPC-CM組(使用50% EPC-CM+50%LG-DMEM培養)和100%EPC-CM組(使用100%EPC-CM培養)，每組設3個復孔。繼續培養24 h后，每孔加入含10% CCK-8的LG-DMEM 100 μl， 37 ℃反應4 h，酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(absorbance， A)值，表示各組ADSCs增殖活性。各組設與實驗平行不加細胞只加培養液的空白對照，以空白孔A值調零后比色。以后每天重復上述CCK-8增殖實驗，共檢測7 d 。上述細胞增殖實驗重復3次。

1.9定性分析堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)及鈣結節取第2代ADSCs，用含10% FBS的LG-DMEM培養基制備細胞懸液，調整細胞密度為5×104/ml，按每孔1種于24孔培養板內，培養24 h后，吸去培養基。將24孔板中細胞按EPC-CM濃度分為3組：對照組、50% EPC-CM組和100%EPC-CM組。每組加入0.5 ml成骨誘導培養基和0.5 ml不同濃度的EPC條件培養基。參考文獻[5]方法，在培養第14天及第21天分別進行ALP及鈣結節的定性檢測。使用(BCIP/NBT)ALP顯色試劑盒進行ALP染色，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。使用茜素紅染料對鈣結節進行染色，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.10定量分析ALP及鈣離子含量按上述分組，每組選取24孔板中6孔進行定量分析。在培養第14天、21天進行鈣離子定量分析，進行定量分析之前48 h換液，茜素紅染色后，每組加入1%氯化十六烷基吡啶400 μl，室溫反應10 min后，酶標儀檢測560 nm波長處的A值，以A值表示各組中鈣離子含量。最后以空白孔A值調零比色。實驗重復3次。進行ALP定量檢測前，首先PBS沖洗細胞2次，0.1% Triton-X100裂解細胞后收集裂解液，12 000 r/min離心10 min后取上清液按ALP檢測試劑盒指示進一步行ALP定量檢測。實驗重復3次, ALP活性以U/L表示。二喹啉甲酸(BCA)法測定各組細胞總蛋白濃度作為參照。

2　結果

2.1EPCs的培養和鑒定EPCs約72 h后可見細胞貼壁，5 d后可見長梭形細胞集落形成，8～10 d可見細胞達到80%～90%融合，細胞集落呈典型“鋪路石”狀(圖1A)。第二代EPCs免疫熒光鑒定結果顯示：VEGER-2陽性(圖1B、1C)， CD133陽性(圖1D)。在鋪被基質膠的96孔板中可形成“管腔樣”結構 (圖2A)，且能夠攝取乙酰化低密度脂蛋白(圖2C)和荊豆凝集素-1(圖2D)，表明目的細胞為EPCs。

2.2ADSCs的培養和鑒定ADSCs于48 h貼壁，原代細胞形態不均一，呈成纖維細胞樣的長梭形(圖3A)。培養48 h后可見集落形成；培養約7 d時細胞鋪滿，經傳代培養后形態逐漸均一呈“旋渦”(圖3B)。CCK-8檢測ADSCs增殖曲線與文獻[6]報道的ADSCs生長趨勢一致。第二代ADSCs免疫熒光鑒定顯示：CD90陽性(圖3C、3D)。經誘導分化培養后能向成骨、成脂及成軟骨方向分化(圖4)。表明目的細胞為ADSCs。

圖1　EPCs形態學鑒定　×100

A:EPCs原代培養7 d；B：DAPI細胞核染陽性；C：FITC標記的VEGFR-2染色陽性；D：TRITC標記的CD133染色陽性

圖2　EPCs的功能鑒定

A：EPCs具有成血管能力×100；B：DAPI細胞核染陽性×200；C：攝取乙酰化低密度脂蛋白能力(陽性)×200；D：結合FITC-UEA-1能力(陽性)×200

2.3ADSCs的增殖活性CCK-8法檢測ADSCs增殖能力：生長培養基培養ADSCs可見ADSCs增殖曲線與文獻報道一致(圖5A)。隨著EPCs條件培養基濃度的增加，ADSCs的增殖活性逐漸增加。ADSCs培養7 d 時間內可見3組ADSCs增殖趨勢相一致(圖5B)。50%EPC-CM組和100%EPC-CM組的ADSCs在各個時間點的增殖活性均高于對照組，差異有統計學意義(表1)。且除外第3天，100%EPC-CM組的ADSC在各時間點的增殖活性高于50%EPC-CM組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖5C、表1。

圖3　ADSCs形態學鑒定　×100A:ADSCs原代培養5 d；B：第二代ADSCs；C：DAPI細胞核染陽性；D：FITC標記的CD90染色陽性

圖4　ADSCs的功能鑒定　×100

A：ADSCs成脂誘導分化后油紅O染色陽性；B：ADSCs成軟骨誘導分化后甲苯胺藍染色陽性；C：ADSCs成骨誘導分化后茜素紅染色陽性

表1　3組中ADSCs 1～7 d的吸光度值與統計學檢驗F值

2.4ALP和鈣離子的定性檢測ADSCs培養14 d及21 d后，ALP染色可見細胞內藍黑色顆粒物，且隨著時間和EPC-CM濃度的增加，各組中染色均可見藍紫色顆粒物，見圖6。隨著誘導培養時間的延長，各組中茜素紅染色均可見紅染的鈣結節，見圖7。

2.5ALP和鈣離子的定量檢測ALP活性檢測：ADSCs誘導培養14 d 后， 50%EPC-CM組中ALP活性與對照組相比，差異無統計學意義，而100%EPC-CM組中ALP活性顯著高于對照組和50%EPC-CM組，差異有統計學意義(F=42.085、56.400，P<0.01)。誘導培養21 d 后，50%EPC-CM組與100%EPC-CM組ALP活性均高于對照組，差異有統計學意義(F=11.211、18.304，P<0.01)，且100% EPC-CM組ALP活性高于50%EPC-CM組，差異有統計學意義(F=5.981，P<0.05)，見圖8。鈣離子定量檢測(A560檢測)：誘導培養14 d 時，50%EPC-CM組和100%EPC-CM組的鈣離子含量均高于對照組，差異有統計學意義(F=420.346、3 685.101，P<0.01)；誘導培養21 d 時，50% EPC-CM組和100% EPC-CM組的鈣離子含量均高于對照組，差異有統計學意義(F=91.933、174.840，P<0.01)。見圖9。

圖5　ADSCs增殖曲線

A：ADSCs于生長培養基中增殖曲線；B：三組ADSCs生長曲線；C：三組ADSCs增殖速率柱狀圖；與對照組比較：*P<0.05；與50%EPC-CM組比較：#P<0.05

3　討論

髓芯減壓和間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植對于早期股骨頭壞死的治療是可選的方案。但部分患者術后未能達到理想效果[7]。影響手術成敗的因素包括股骨頭壞死灶的大小，壞死的病因，以及移植所用的MSCs的活性[7-8]。有研究[9]表明激素性股骨頭壞死和酒精性股骨頭壞死的患者，其骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells ,BMSCs)的成骨活性大大降低，這可能是導致手術失敗的原因之一。為了應對手術失敗的風險，尋找其他來源的MSCs就顯得非常重要。Wyles et al[1]已經證實，人來源的ADSCs在體外的增殖活性和成骨能力均高于BMSCs。Strioga et al[6]報道這可能是因為ADSCs來源于脂肪，在人體中更類似于生理緩沖區，BMSCs則需要不斷適應身體動態環境的刺激。且相比較與BMSCs，ADSCs具有多向分化能力，而且只需要極小的創口下即可在人體的脂肪組織中獲取，其體外擴增速度遠高于BMSCs，是組織工程可以選用的優良種子細胞。

盡管MSCs和EPCs之間的直接和間接相互作用機制仍未能完全闡述清楚，但是Kim et al[10]已經證實了骨髓來源的細胞能夠表達和分泌血管內皮生長因子(VEGF)等數種細胞因子，而VEGF能夠促進間充質干細胞的增殖和成骨分化能力[11]。ALP是一種細胞成骨的早期標志物，Zhao et al[12]已經證實在EPCs和MSCs直接共培養的情況下ALP活性會出現明顯增加，但難以確定這種作用是否只存在于兩種細胞直接接觸的情況下，以及細胞分泌的VEGF等細胞因子對這種促進作用是否具有影響。體外環境與體內環境不同，體外環境在可控范圍內可以避免大部分的其他細胞和分泌蛋白的干擾，體外環境也更容易控制，能夠真實地反映實驗因素產生的影響，所以本實驗采用在體外分離培養兩種細胞，通過制作EPCs的條件培養基培養MSCs，以研究EPCs分泌的細胞因子對于MSCs的增殖與分化是否仍存在影響。

在骨的發育、修復、重構等過程中，快速的血管化可以供應給骨質內部細胞足夠的營養、氧氣并幫助其運送代謝廢物。同時在組織工程中血管還可以幫助運送降解的支架，促進新骨的形成。Kaigler et al[13]將內皮細胞分別培養于3種不同的培養基中，包括單一的生長培養基、加入了VEGF的生長培養基和加入了BMSCs條件培養基的生長培養基。其中后兩種培養基中培養的內皮細胞其血管生發速度大大提升。這個實驗證實了將成血管細胞與組織工程的種子細胞一起移植，能夠大大的促進移植材料的血管化速度。

本實驗雖證實了EPCs條件培養基可促進ADSCs的增殖和分化，且隨著條件培養基濃度的增加，這種影響也逐漸增強，但并未完全闡明條件培養基中何種細胞因子通過何種方式發揮作用，且未能盡述其中的細胞因子是否具有協同作用或拮抗作用。且體內環境與體外環境存在較大差異，兩種細胞在活體內的相互作用方式及相互影響的作用機制仍有待進一步研究。

圖6　ALP定性鑒定　ALP染色×100

圖7　鈣結節定性鑒定　茜素紅染色×100

圖8　ADSCs經誘導培養后ALP定量檢測

與對照組相比：*P<0.05；與50% EPC-CM組相比：#P<0.05

圖9　鈣離子含量定量檢測

參考文獻