某醫(yī)院黏質(zhì)沙雷菌碳青霉烯耐藥機制及流行病學(xué)研究

饒碧華，儲新民

黏質(zhì)沙雷菌是腸桿菌科中重要的條件致病菌之一，常貯存于成人泌尿道、呼吸道以及兒童的胃腸道等部位，當(dāng)機體免疫功能降低可引起泌尿系統(tǒng)感染、肺炎、敗血癥等。根據(jù)2014～2016年CHINET中國細(xì)菌耐藥性檢測報告，提示近年來黏質(zhì)沙雷菌分離率和耐藥率日益上升，2016年沙雷菌屬占所有標(biāo)本分離菌株的1.16%，居革蘭陰性桿革菌的第9位，已經(jīng)成為臨床上醫(yī)院感染重要病原菌屬。黏質(zhì)沙雷菌是沙雷菌屬中臨床最常見的一種，定期監(jiān)測其臨床分布和耐藥性變化對預(yù)防和控制醫(yī)院感染極為重要。碳青霉烯類抗生素對幾乎所有由質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，且具有良好的通透性，是目前抗菌譜最廣的抗菌藥物，具有快速殺菌的作用，包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南、帕尼培南等[1]，是治療細(xì)菌感染的終極武器。但是，近年來隨著碳青霉烯類藥物在臨床上廣泛使用，對碳青霉烯類藥物耐藥的黏質(zhì)沙雷菌比例日益增高，給患者的感染控制帶來了嚴(yán)峻考驗。該實驗主要研究黏質(zhì)沙雷菌碳青霉烯耐藥機制，同時對耐藥菌的同源性進(jìn)行探究，為院內(nèi)爆發(fā)性感染進(jìn)行預(yù)防控制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株的來源收集院內(nèi)2017年3～7月臨床分離物中無重復(fù)患者的黏質(zhì)沙雷菌株25株，其中非敏感菌株17株(14株耐藥、3株中介)作為實驗標(biāo)本。質(zhì)控菌株為大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、ATCC8739和肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706。

1.2儀器與試劑主要儀器包括VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)(法國梅里埃生物公司)；MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(北京毅新博創(chuàng)生物科技公司)；Biometra PCR擴增儀(德國Biometra公司)；POWERPAC BASIC電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Bio-Top凝膠成像儀(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；Sigma 1-14小型臺式離心機(德國西格瑪公司)。主要試劑包括 GN鑒定卡和GN13藥敏卡(法國梅里埃生物公司)；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒和即用PCR擴增試劑盒(上海生工生物工程公司)；藥敏紙片(英國OXOID公司)。

1.3引物引物SME-1、VIM-2、IMP-1、OXA-23、OXA-48、NDM-1、KPC-2、TEM、SHV、GES、CTX-M-1、CTX-M-2，CTX-M-9由clone manager設(shè)計，CTX-M-9、ERIC參考文獻(xiàn)[2-3]，由安徽通用生物公司合成，見表1。

1.4碳青霉烯耐藥表型篩選參照CLSI指南應(yīng)用改良Hodge試驗(modified Hodge test, MHT)檢測，被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌環(huán)交匯處大腸埃希菌生長增強，即為改良Hodge試驗陽性，提示待測菌株產(chǎn)生碳青霉烯酶。肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706分別為陽性和陰性的質(zhì)控菌株。

1.5細(xì)菌鑒定與藥敏應(yīng)用VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，運用飛行時間質(zhì)譜儀來進(jìn)行復(fù)核細(xì)菌鑒定結(jié)果，以保證實驗菌株的準(zhǔn)確性。另外，運用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)檢測MIC，根據(jù) CLSI M100 S25 標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.6耐藥基因的檢測與分析提取基因組DNA作為模板，設(shè)置PCR反應(yīng)體系為50 μl，其包括sterilized ddH2O222 μl、2 × HiFi-PCR Master 25 μl、DNA模板1 μl、上下游引物各1 μl(濃度為20 μmol/L )。PCR擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。配制1%的瓊脂糖凝膠對產(chǎn)物進(jìn)行電泳45 min，結(jié)束后凝膠成像儀內(nèi)紫外燈觀察結(jié)果。

1.7同源性分析利用ERIC-PCR對17株耐藥黏質(zhì)沙雷菌進(jìn)行同源性分析，反應(yīng)體系如1.6所述，PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性7 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，65 ℃延伸6 min，30個循環(huán)，65 ℃延伸12 min。配制1.2%的瓊脂糖凝膠在100 V電壓下對產(chǎn)物進(jìn)行電泳70 min，結(jié)束后置凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)本來源基本情況分析患者年齡1～100(64±28)歲，其中男14例(82.4%)，女3例(17.6%)。以深部痰標(biāo)本為主(15株，89.5%)，僅2株為引流液標(biāo)本(10.5%)。科室分布主要為重癥醫(yī)學(xué)科(10株，58.8%)，其次為干部病房(5株，29.4%)和腦外科(2株，11.8%)。

2.2改良Hodge試驗的結(jié)果17株細(xì)菌中MHT陽性14株(82.4%)。其中部分陽性結(jié)果示意圖見圖1，其中1705、1706分別為MHT的陽性及陰性質(zhì)控菌株。

2.3藥敏結(jié)果分析17株非敏感菌對氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、厄他培南、亞胺培南、慶大霉素高度耐藥，呈現(xiàn)明顯的多重耐藥的特征，對阿米卡星和復(fù)方新諾明敏感。8株敏感菌僅對頭孢曲松表現(xiàn)出高度耐藥和妥布霉素中介，其余藥物敏感性較高。見表2。

2.4耐藥基因特異性引物PCR擴增結(jié)果PCR擴增后進(jìn)行測序，最后確認(rèn)檢測出10株細(xì)菌含有CTX-M-14，5株含有KPC-2，2株含有TEM，1株含有NDM-1，1株含有SHV基因，并出現(xiàn)了6株細(xì)菌同時含有多種耐藥基因的情況，同時也有5株細(xì)菌未檢出任何耐藥基因。耐藥基因SME-1、VIM-2、IMP-1、OXA-23、OXA-48、GES、CTX-M-1、CTX-M-2均未檢出陽性結(jié)果，見圖2、3。

表2　17株耐碳青霉烯類和8株敏感黏質(zhì)沙雷菌藥敏結(jié)果(n)

R(resistance,耐藥);S(sensitive,敏感);I(intermediate,中介)

圖1　部分黏質(zhì)沙雷菌MHT結(jié)果

圖2　17株細(xì)菌KPC-2陽性結(jié)果示意圖

M：DL Marker 2 000；N：陰性對照；3、4、12、15、17：陽性標(biāo)本，分子大小為734 bp;其余為陰性標(biāo)本

2.5同源性分析結(jié)果判斷依據(jù)條帶完全相同者為同一基因型，相差一條為同一基因型中的不同亞型，相差兩條以上為不同基因型[4]。實驗結(jié)果判斷17株細(xì)菌中有11株(1、3、5、6、7、10、11、13、14、15、17)為同一型別，2、4、8、9、12、16為各自型別，見圖4。

圖3　17株細(xì)菌NDM-1陽性結(jié)果示意圖

M：DL Marker 2 000；N：陰性對照；16：陽性標(biāo)本，分子大小為697 bp;其余為陰性標(biāo)本

圖4　17株細(xì)菌ERIC-PCR分型

3　討論

黏質(zhì)沙雷菌具有侵襲性并對多種常用的抗生素天然耐藥，是引起腸道外感染的重要病原菌，可致肺炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)、外科手術(shù)部位等感染。通過對收集菌株來源的分析，結(jié)果顯示耐碳青霉烯黏質(zhì)沙雷主要來自重癥醫(yī)學(xué)科和干部病房，患者平均年齡64歲，說明患者年齡大以及自身免疫情況差是黏質(zhì)沙雷菌感染的重要因素，與黃中海 等[5]研究一致。其耐碳青霉烯抗生素問題已經(jīng)引起了高度關(guān)注，2014、2015年CHINET全國耐藥監(jiān)測顯示黏質(zhì)沙雷對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為6.7%、7.0%和8.1%、8.3%，直至2016年的8.6%、8.3%，耐藥率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢[6]。在本院收集的25株黏質(zhì)沙雷菌中，14株對碳青霉烯類藥物耐藥，并有3株呈現(xiàn)出中介的情況，耐藥的比例高達(dá)56%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全國平均水平。

分析2016年CHINET全國藥敏數(shù)據(jù)顯示沙雷菌屬對厄他培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、阿米卡星、亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均≤10%，而本次研究收集的25株黏質(zhì)沙雷菌藥敏結(jié)果僅阿米卡星與CHINET結(jié)果一致，厄他培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率遠(yuǎn)高于全國平均數(shù)據(jù)。17株耐碳青霉烯類黏質(zhì)沙雷菌與侯滬 等[7]文獻(xiàn)中提到的165株耐碳青霉烯黏質(zhì)沙雷菌藥敏結(jié)果相比較，阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、慶大霉素、復(fù)方新諾明耐藥率較為一致；頭孢他啶、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦差異較大，除哌拉西林/他唑巴坦耐藥率為0之外，其他耐藥率均大幅度高于其藥敏結(jié)果。說明本院黏質(zhì)沙雷菌耐藥情況嚴(yán)重，抗生素選擇有限，推薦臨床使用阿米卡星或復(fù)方新諾明治療，其他藥物根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用。

黏質(zhì)沙雷菌耐藥機制復(fù)雜，包括：① 產(chǎn)碳青霉烯酶；② 高產(chǎn)ESBL或高產(chǎn) AmpC酶合并孔道蛋白缺失或下調(diào)，導(dǎo)致對碳青霉烯類抗生素的敏感性降低；③ 碳青霉烯類抗生素的作用靶點PBP蛋白改變。產(chǎn)碳青霉烯酶為耐碳青霉烯類黏質(zhì)沙雷菌的主要機制[8]。在本次的研究中檢測出了KPC-2、NDM-1碳青霉烯酶和TEM、SHV、CTX-M-14超廣譜酶。KPC-2是我國目前腸桿菌科細(xì)菌耐碳青霉烯類藥物最常見的碳青霉烯酶[8-9]。依據(jù)Bush分類，KPC屬于絲氨酸酶A中的2f分類。最初于2001年在美國北卡羅來納州于肺炎克雷伯菌分離株中被描述，并且在全世界迅速出現(xiàn)并傳播，特別是腸桿科細(xì)菌中。隨后主要在美國、中國、以色列和幾個歐洲國家被報道。Cuzon et al[10]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌含有KPC-2時并會同時具有其他獲得性β-內(nèi)酰胺酶基因，與本次實驗結(jié)果較為符合。此次實驗還發(fā)現(xiàn)了國內(nèi)偶見報道的NDM-1基因，NDM-1陽性菌株的首次發(fā)現(xiàn)是在2008年瑞典，一位由于在印度新德里獲得肺炎克雷伯菌感染而引起尿路感染的患者中[11]。NDM-1是一種超級耐藥基因，能夠編碼新的耐藥酶，全稱為“新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶1”。此酶具有高效性，能水解除氨曲南以外的所有β-內(nèi)酰胺類藥物[12]。產(chǎn)生NDM-1的多重耐藥細(xì)菌引起的感染通常需要兩種或三種抗生素聯(lián)合治療[11]。

在本研究中運用到的MHT易于操作，無需特殊的試劑或者培養(yǎng)基就可以檢測碳青霉烯酶。17株細(xì)菌中14株結(jié)果為陽性，與PCR擴增結(jié)果相一致，同時也出現(xiàn)了MHT陽性但并未檢測出耐藥基因，可能原因為菌株產(chǎn)ESBL或AmpC合并外膜蛋白缺失[13]。這個需要下一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測外膜蛋白情況和RT-PCR半定量表達(dá)的AmpC。

ERIC-PCR揭示了17株細(xì)菌的同源性情況。由于每個細(xì)菌基因組上的ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，ERIC-PCR通過對兩個相鄰的ERIC保守序列之間區(qū)域的擴增，可以得到由一系列大小不同片段組成的DNA指紋圖譜。通過ERIC-PCR鑒定17株細(xì)菌中11株為同一個型別，其他6株為各自不同型別。這11株細(xì)菌的同型別提示應(yīng)當(dāng)注意耐碳青霉烯類黏質(zhì)沙雷在醫(yī)院內(nèi)的播散。碳青霉烯酶可以通過諸如整合子或質(zhì)粒的移動元件進(jìn)行擴散，不斷的監(jiān)視將是防止傳播的最佳措施之一[14]。加強無菌物品和各種管道及醫(yī)療設(shè)施、器械的消毒管理；加強手衛(wèi)生的管理，提高醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生的意識；嚴(yán)格實施無菌操作和消毒隔離措施，防止患者之間的交叉感染[15]；合理、謹(jǐn)慎地使用抗菌藥物，以延緩和減少耐藥菌的產(chǎn)生。總而言之，醫(yī)院黏質(zhì)沙雷菌檢出率較高，耐藥性增加，耐藥機制復(fù)雜，應(yīng)強調(diào)臨床合理選擇用藥和持續(xù)監(jiān)督及有效預(yù)防措施，以控制和減少耐碳青霉烯類黏質(zhì)沙雷菌的傳播。