JAK2、CALR及MPL基因突變檢測對BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤的診斷價值

楊　艷，熊術道，陶千山，王極宇，劉　軍，李曼曼，翟志敏

骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms, MPNs),也稱慢性骨髓增殖性疾病(chronic myeloproliferative diseases,CMPDs)，指分化相對成熟的一系或多系骨髓細胞惡性增殖所致的一組造血系統腫瘤性疾病，各病癥之間可共存或相互轉化，最終進展為骨髓衰竭或轉化為急性白血病[1-2]。2001年WHO分類將CMPDs分為四種經典疾病,即BCR-ABL陽性慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、真性紅細胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發性血小板增多癥(essential thombocytosis，ET)、原發性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)及其它非經典疾病，包括慢性中性粒細胞白血病(chronic neutrophilic leukemia，CNL)、慢性嗜酸性粒細胞白血病/高嗜酸性粒細胞綜合征(chronic eosinophilic leukemia/hypereosinophilic syndrome,CEL/HES)、不能分類的骨髓增殖性疾病(CMPD- unclassifiable, CMPD-U)[1]。隨著分子生物學的不斷研究，2008年WHO分型即根據疾病的腫瘤性特征，將其更名為MPNs，并包含肥大細胞增生癥(mastocytosis)，而CEL/HES則重新分為三大類, 即慢性嗜酸性粒細胞白血病-非特指型(CEL not otherwise specified, CEL-NOS)、HES和伴有嗜酸細胞增多和PDGFRA、PDGFRB和FGFR1異常的髓系或淋系腫瘤,前兩類仍屬于MPNs,而第三種則劃分為髓系腫瘤的一種新亞型[2]。MPNs以中老年人常見,近年來發病率呈上升趨勢[3-4]，因而需高度重視、及早診治。臨床上一直亟待找到像BCR-ABL融合基因這樣敏感性強、特異性高的分子標志物來協助診斷BCR-ABL陰性MPN。直到2005年JAK2 V617F突變被在PV患者中首先發現[5]，接著JAK2基因12號外顯子、MPL及CALR等突變也在BCR-ABL陰性MPN中被相繼發現，現有研究[6]顯示這四種突變基因在BCR-ABL陰性MPN的臨床診斷等方面有重要作用。該研究旨在探討這幾種突變基因在BCR-ABL陰性MPN臨床診斷的運用價值。

1　材料與方法

1.1病例資料收集2013年1月～2017年8月于安徽醫科大學第二附屬醫院就診的345例外周血細胞計數異常且臨床表現疑似MPNs患者的臨床資料進行回顧性分析。排除標準：① 年齡小于18歲；② 沒法獲取組織病理學診斷結果；③ 未將這四種突變基因均檢測的；④ 精神障礙者。

符合入組條件者171例，其中符合WHO診斷標準最終確診的106例BCR-ABL陰性MPN患者作為病例組：包括經典的BCR-ABL陰性MPN 101例、MPN-U 4例、IHES 1例，其中10例骨髓病理檢查結果不符合WHO診斷標準，但結合其他診斷條件最終仍確診為MPN；65例非BCR-ABL陰性MPN患者作為對照組：BCR-ABL陽性CML 19例；非MPN患者53例，其中骨髓增生異常綜合征5例、骨髓增生異常綜合征/骨髓增殖性腫瘤10例、急性髓系白血病1例、缺鐵性貧血4例、再生障礙性貧血1例、巨幼細胞性貧血1例、繼發性骨髓纖維化2例、其他血液系統惡性疾病繼發的血細胞增多2例；非血液系統惡性腫瘤2例、感染、炎癥及免疫性等相關的血細胞增多癥18例。所有病例符合2001年WHO診斷標準[1]。本研究獲得了醫院倫理委員會批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2主要儀器和試劑實時定量PCR儀(西安天隆科技有限公司，TL988)；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；骨髓增殖性腫瘤相關基因突變檢測試劑盒(PCR熒光探針法)(上海源奇生物醫藥科技有限公司)；PremixTaqTM(日本TaKaRa公司，TaqTMVersion2.0plusdye)；引物和探針由上海源奇生物醫藥科技有限公司合成。

1.3基因組DNA提取及基因檢測

1.3.1基因組DNA提取取患者骨髓2 ml，EDTA-K2抗凝,使用DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，具體操作參照說明書。

1.3.2基因檢測使用qRT-PCR(Taqman探針法) 檢測JAK2 V617F、JAK2 12號外顯子、MPL及CALR突變。PCR擴增反應體系為25 μl，擴增條件: 預變性42 ℃ 5 min, 變性94 ℃ 3 min ;退火94 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min，50個循環;延伸25 ℃ 5 min,在60 ℃時采集熒光信號，擴增結束后直接使用實時定量PCR儀分析軟件分析檢測結果。

2　結果

2.1病例組與對照組臨床特征最終入組患者171例，其中病例組106例，選擇同期年齡、性別比例相匹配的65例患者設為對照組。研究結果顯示，JAK2 V617F及CALR突變陽性率在兩組中有顯著性差異(P<0.01)，提示這兩種基因突變檢測對于鑒別BCR-ABL陰性MPN有一定特異性。最終入組患者中MPL突變僅檢出3例，故其發生率及臨床意義仍需進一步探討，而本研究未檢測到JAK2 12號外顯子突變。見表 1。

表1　病例組與對照組臨床特征

2.2單獨和聯合檢測JAK2V617F、MPL及CALR突變在BCR-ABL陰性MPN診斷中的價值研究顯示，JAK2 V617F突變與MPL和CALR突變相比，診斷BCR-ABL陰性MPN的靈敏度、陰性預測值、約登指數、診斷符合率均最高，Kappa檢驗顯示Kappa=0.590，提示JAK2 V617F突變在診斷上與WHO診斷標準一致性和準確度最高，但其特異度及陽性預測值稍低。CALR與JAK2 V617F及MPL突變相比，特異度及陽性預測值最高，提示應用CALR突變誤診率最低。當3種突變基因聯合檢測時，靈敏度、陰性預測值分別進一步提高至84.9%、79.2%，且符合率升高(88.3%)，Kappa檢測Kappa=0.76，提示與金標準有較強的一致性，同時可保持一定特異度(93.9%)。見表2。

2.3101例經典的BCR-ABL陰性MPN患者臨床特征為進一步驗證JAK2 V617F、MPL及CALR突變在BCR-ABL陰性MPN患者的臨床意義，選取PV、ET、PMF 3組患者分別比較基因突變、骨髓病理的診斷結果與WHO診斷標準的符合率情況。由于MPN-U及IHES病例數少暫不予進一步分析。見表3。

2.4101例經典的BCR-ABL陰性MPN患者JAK2、MPL、CALR3種突變基因聯合檢測和骨髓病理診斷與WHO診斷符合率比較在對疾病診斷的準確性判斷方面，以WHO診斷標準的結果為參考，基因突變診斷總的符合率為85.1%，其中PV組患者的符合率最高為96.0% ( 24/25 );其次是ET組患者83.6% ( 51/61 );PMF組患者符合率稍低為73.3% ( 11/15)。單獨骨髓病理診斷總符合率為90.1%，其中以PMF組最高為100%，其次是ET組(90.2%)、PV組(84.0%)。基因突變、骨髓病理診斷分別與WHO診斷標準的符合率比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示兩種診斷方法準確性高度一致。見表4。

2.5101例經典的BCR-ABL陰性MPN患者JAK2、MPL、CALR3種突變基因聯合檢測、骨髓病理之間診斷一致符合率比較基因突變、骨髓病理診斷分別與WHO診斷標準的符合率比較大致相同，故為進一步驗證這兩種方法診斷價值，再次比較了基因診斷與骨髓病理診斷之間的符合度情況。結果兩種方法對101例BCR-ABL患者診斷結果相同共76對，診斷符合率為75.2%。其中PV組兩種方法診斷一致的符合率最高為80.0% ;其次是ET組為73.8%; PMF組符合率最低為73.3%。提示兩種方法對診斷經典的BCR-ABL陰性MPN患者差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

3　討論

表2　病例組與對照組基因突變陽性檢測結果

表3　101例經典的BCR-ABL陰性MPN患者臨床特征

表4　101例經典的BCR-ABL陰性MPN患者JAK2、MPL、CALR3種基因突變聯合檢測和骨髓病理診斷符合率分析[n(%)]

從本研究中可以得出，BCR-ABL陰性MPN患者60%以上為老年人，與國內外相關研究結果大致相仿，本研究患者主要以ET為主，其次為PV，PMF、MPN-U、IHES患者較少，JAK2 V617F突變陽性率在PV、ET、PMF分別為96.0%、62.3%、46.7%，MPL和CALR突變在ET、PMF中陽性率分別為1.6%、6.7%和19.7%、20.0%，在BCR-ABL陽性CML患者及其他非MPN患者中，共檢測出3例JAK2 V617F突變、1例MPL突變，未檢測到CALR突變，與國內外研究[13-17]結果相仿。而本組4例MPN-U均檢出JAK2 V617F突變，與Singdong et al[15]研究相一致，但仍高于部分國內外研究水平[16-17]，考慮原因為病例數較少、隨訪時間短，故其發生率及臨床意義仍需進一步探討。以上研究結果揭示BCR-ABL陰性MPN患者JAK2 V617F、CALR基因突變陽性率與引起血細胞增多的其他血液系統疾病或非血液系統疾病有顯著性差異，可以作為篩查BCR-ABL陰性的MPN患者的重要指標。因此為證實基因突變診斷價值，本研究對這幾種基因診斷的真實性及可靠性做了相關實驗，結果顯示，相比于單獨檢測，當聯合檢測這3種突變時，靈敏度、陰性預測值分別進一步提高，同時可以保持一定的特異度，且聯合檢測與WHO診斷標準的符合率最高，Kappa檢測Kappa=0.76，提示與WHO診斷標準有較強的一致性。因此基因突變檢測有助于早期臨床識別本病，提高診斷率，降低誤診及漏診率，從而及時干預，減少并發癥的發生，提高患者生活質量。

另外對于MPNs，骨髓病理有很大的診斷及鑒別診斷價值，因此以WHO診斷標準的診斷結果為參考，比較在經典的BCR-ABL陰性MPN患者中，單獨使用基因突變診斷和單獨骨髓病理診斷結果與WHO診斷標準的診斷結果一致的符合率情況，結果顯示兩種方法比較診斷符合率無顯著差異，提示兩者與WHO診斷標準診斷的準確性高度一致。接著本研究繼續比較了基因診斷與骨髓病理診斷結果一致的符合率情況，從而進一步驗證基因突變檢測的臨床診斷意義。結果顯示，兩種方法診斷一致符合率為75.2% (P>0.05)，仍提示兩種方法準確性高度一致。但兩種方法各有缺點很難互相替代，骨髓病理判斷可能存在人為的主觀臆斷，部分早期患者骨髓病理表現不典型；而JAK2 V617F、CALR、MPL突變難以明確判斷MPNs具體亞型，故臨床需兩種方法協助診斷，可能會使臨床診斷、早期治療干預、預防并發癥、改善預后等方面取得更大獲益。如今，隨著高通量技術的廣泛應用，已有更多基因突變類型在MPNs中被檢測到[8]，期待未來能發現如BCR-ABL融合基因一樣對疾病具體亞型有高度特異性的分子標志。

本研究仍存有一定局限性:① 雖然納入345例患者，但最終符合入組條件者僅171例，且僅4例MPN-U、1例IHES，也無其他MPN亞型，需要繼續隨訪及補充;② 本研究的樣本均來自本院，缺乏多中心數據，后續還需要聯合多中心研究、擴大樣本量繼續驗證此研究結論。

通過以上的整改措施，醫保投訴管理得到了完善和加強，降低了患者醫保相關投訴發生率，達到了預期效果，提高了患者的信任度和滿意度。在落實措施同時，派工作人員分別到接待中心輪轉，體驗患者感受，體會患者需求，促使工作人員對患者投訴的重視程度進一步提高。

參考文獻