STIL在肝細胞癌中高表達及其預后價值

袁勇剛，李文娟，周杭城，彭　燕，王　偉，胡　冰

肝細胞癌，簡稱肝癌，是常見的消化道惡性腫瘤之一，具有易侵襲轉移等特點，患者預后極差[1-2]。目前有關肝癌診療及找尋預測預后的有效生物學指標是該領域的研究熱點。STIL(SCL/TAL1 interrupting locus，STIL)基因是從人類急性T淋巴細胞白血病相關染色體重排中克隆而來，其進化高度保守，主要與中心體形成及數目調控、紡錘體形成和染色體分離密切相關[3-4]。研究[5-6]表明，STIL還可作為一種癌基因在肺癌、胰腺癌等組織中表達增高，且其高表達與腫瘤侵襲及預后有關，但在肝癌中的表達及預后意義尚未見詳細報道。該研究采用生物信息學預測結合免疫組化驗證的方法探討STIL在肝癌中的表達水平及其預后價值。

1　材料與方法

1.1生物信息學預測選擇癌癥公共數據庫Oncomine和TCGA進行生物信息學預測。在Oncomine數據庫中輸入基因名“STIL”和差異基因分析模塊輸入“Hepatocellular carcinomavsnormal”檢索分析結果；下載TCGA數據庫中的肝癌數據，共有364例肝癌患者具有STIL基因表達的信息，按其表達水平高低降序排列，排名前50%計為STIL高表達(182例)，排名后50%計為STIL低表達(182例)，而后與患者的總生存期(overall survival，OS)關聯，運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

1.2肝癌患者標本及其臨床病理資料回顧性收集2010年6月～2016年9月在安徽醫科大學附屬省立醫院行肝切除術的肝癌患者(共計67例)的癌與癌旁配對的石蠟組織標本，術后病理均證實肝癌，隨訪時間截止到2017年9月。患者相關的臨床信息包括：性別、年齡、腫瘤大小、有無肝硬化、有無脈管侵犯、TNM分期等。本研究已經安徽醫科大學附屬省立醫院倫理委員會審批，所有患者已簽署知情同意書。

1.3免疫組化染色及結果判讀采用免疫組織化學染色SP法對上述標本進行檢測，具體操作方法按照試劑說明書進行。一抗為STIL兔多克隆抗體(貨號：ab222838)，購自英國Abcam公司，工作濃度為1 ∶500。染色結果判讀：結果采用盲法測定，每張切片均由兩名病理科醫師進行獨立判斷，參照之前的判讀方法[7]，根據染色強度(staining intensity，SI)乘以染色陽性細胞數(percentage of positive cells，PP)的百分比計算免疫反應性評分(IRS)，詳細評分標準如下：SI(0～3分)：0為陰性，1例為弱陽性，2例為中度陽性，3例為強陽性；PP(0～4分)：0為陰性，1為1%～25%，2為26%～50%，3為51%～75%，4為76%～100%。IRS評分范圍為0～12分，若IRS> 4分，則計為STIL高表達；若IRS≤4分，則定義為STIL低表達。

1.4統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析。公共數據庫Oncomine和TCGA下載的肝癌與正常組織數據之間的對比采用兩獨立樣本t檢驗。率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，Kaplan-Meier法(log-rank test)進行單因素生存分析，而后將在單因素生存分析有意義的因素代入進行Cox多因素生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1肝癌及癌旁組織中STIL的表達水平Oncomine數據庫共檢索到4項有關“肝細胞癌vs正常肝組織”的研究涉及到有STIL基因mRNA表達水平的信息(圖1)，結果均顯示：與正常肝組織相比，STIL基因mRNA在肝癌中呈現顯著高表達，差異有統計學意義。隨后，為驗證上述預測結果，采用免疫組化法對67例肝癌和癌旁配對組織進行檢測，結果顯示：STIL蛋白主要表達于肝癌細胞質中(圖2A)，其在肝癌中高表達陽性率為65.7%，而在配對癌旁正常組織中多為低表達(圖2B)，高表達陽性率僅為37.3%，兩組的表達率差異有統計學意義(χ2=10.786，P=0.001)，見表1。這一蛋白表達結果與Oncomine數據庫預測的mRNA表達結果相一致。

圖1　Oncomine數據庫預測STIL基因在肝癌中高表達

A: Roessler Liver(GEO：GSE14520)；B：Mas Liver(GEO：GSE14323)；C：Roessler Liver 2(GEO：GSE14520)；D：Wurmbach Liver(GEO：GSE6764)

圖2　STIL基因在肝癌及癌旁正常組織中的蛋白表達水平(bar=50 μm)

2.2肝癌中STIL的差異表達與患者臨床病理參數的關系隨后，對肝癌中STIL差異表達水平與患者的各項臨床病理參數的關系進行檢測顯示(表2)：STIL的不同表達水平(高表達vs低表達)與患者的年齡(≤60歲vs> 60歲)、性別(男性vs女性)、Edmondson分級(Ⅰ～Ⅱ級vsⅢ～Ⅳ級)、腫瘤大小(≤ 5 cmvs>5 cm)、脈管侵犯(有vs無)及肝硬化(有vs無)指標差異均有統計學意義，而僅與TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期vsⅢ～Ⅳ期)有關(P=0.006)。

4.創新活動載體。要提高黨組織的凝聚力和戰斗力，創新活動載體、保證活動成效十分關鍵。結合社會組織主要分布在油田各行各業、在職黨員具有較強的業務知識等特點，引導社會組織“適時、適宜、適度”地參與油田各項建設，引導他們參與油田的各項便民利民服務，如定期不定期舉辦法律、醫療保健，家庭理財等方面的咨詢服務等，并通過建立服務志愿者隊伍，把參與結果作為吸收入黨、評選先進的一項重要參考指標，吸引更多的新社會組織從業人員投入到油田發展，使越來越多的員工群眾從中受益。

表1　STIL在肝癌及配對癌旁組織中的蛋白表達水平[n(%)]

表2　STIL差異表達水平與肝癌患者各臨床病理參數的關系(n)

a表示采用Fisher精確概率法，其余應用χ2檢驗

2.3肝癌中STIL的表達預測患者預后的價值對STIL基因差異表達水平與肝癌患者預后的關系進行探索。TCGA數據庫預測的結果顯示：STIL基因mRNA水平高表達的肝癌患者預后顯著差于其低表達患者(圖3A，P=0.003)。為驗證這一結果，隨后對免疫組化檢測的結果進行統計分析顯示：與之相似，STIL基因蛋白高表達的肝癌患者的生存時間顯著低于其低表達者，差異有統計學意義(圖3B，P<0.001)；Kaplan-Meier單因素生存分析顯示：STIL表達水平(高表達vs低表達)、脈管侵犯(有vs無)以及TNM分期(Ⅰ-Ⅱ期vsⅢ-Ⅳ期)是影響肝癌患者生存時間差異的顯著因素(表3)；而將這3個有意義的單因素代入Cox多因素生存分析中顯示：STIL表達水平以及TNM分期可作為肝癌患者預后的獨立預測因子(P<0.001，P=0.001)，見表4。

3　討論

肝癌在我國屬于較常見高發的惡性消化道腫瘤，具有富血管性、易復發轉移等特點，其常見治療手段包括肝切除術、肝移植、TACE介入治療等，但對傳統的化療藥物不敏感，患者一般預后較差。因此，進一步探索及開發有價值的生物標志物來預測療效或成為靶向治療的有效藥物顯得尤為必要和迫切。STIL基因屬于中心粒復制相關因子，源于與人類急性淋巴細胞白血病相關染色體重排克隆，近期有研究[8-9]表明其可通過調節中心體結構與數目，影響染色體不穩定性形成，參與惡性腫瘤的發生和發展。但STIL基因在肝癌中的表達情況及其是否對肝癌患者的預后有預測價值尚不清楚。

表3　肝癌患者的Kaplan-Meier單因素生存分析

表4　肝癌患者的Cox多因素生存分析

因此在本實驗中，首先運用生物信息學的方法，在Oncomine公共數據庫預測到STIL基因在肝癌組織中的表達明顯高于正常組織(P<0.05)；然后，采用免疫組化的方法對收集的67例肝癌及配對的癌旁組織進行檢測顯示：與正常肝組織相比，STIL蛋白在肝癌組織中顯著高表達，差異有統計學意義(P<0.001)。這一真實數據結果與生物信息學預測結果相一致。事實上，STIL基因在已報道的多種惡性腫瘤中呈現高表達，如肺癌[4]、結腸癌[9]、胰腺癌[6]及胃癌[10]。這些結果也一定程度上提示：STIL基因在惡性腫瘤中可能扮演著促癌基因的角色參與著腫瘤發生發展等生物學進程。

圖3　基于STIL差異表達水平應用Kaplan-Meier法繪制的總生存曲線

A：基于TCGA數據庫預測的STIL基因mRNA水平與總生存期曲線；B：基于真實數據STIL基因蛋白水平與總生存曲線

隨后，又對STIL基因表達水平與肝癌患者的臨床預后意義進行了探索。首先相關性分析顯示：STIL的差異表達與肝癌患者的TNM分期有關；隨后運用Kaplan-Meier單因素生存分析(log-rank test法)顯示：STIL高與低的差異表達水平、有無脈管侵犯以及TNM不同分期的肝癌患者其生存時間差異具有統計學意義；而將這3個有意義的單因素代入Cox多因素生存分析顯示：STIL高表達以及TNM分期(Ⅲ-Ⅳ)是可作為預測肝癌患者預后不佳的獨立預測因子。這一結果與利用TCGA公共數據庫的數據預測結果相一致。而在其它惡性腫瘤中，研究者們也發現與之類似的現象：STIL基因高表達可以促進腫瘤細胞增殖、生長、侵襲轉移。上述結果提示：STIL基因高表達預示著肝癌患者預后不佳，該基因可能是參與肝癌生長、轉移等過程的關鍵靶點基因，但其詳細機制尚不清楚。

綜上，本研究結果證實STIL基因在肝癌中高表達，且高表達的STIL可以作為預測肝癌患者預后不佳的獨立預測因子。未來STIL基因有望成為肝癌患者治療的新靶點。

參考文獻