基于I TS2條形碼的貫葉金絲桃及其混偽品鑒別研究*

楊宋琪，唐小龍，陳海燕，柯 瀟

（四川濟生堂藥業有限公司，四川 成都 610041）

貫葉金絲桃 Hypericum perforatum L．，別名貫葉連翹、千層樓、圣約翰草等，為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，原產于歐洲和亞洲，在我國陜西、甘肅、山東、新疆、四川、貴州等地均有分布[1－3]。現代研究表明，其成分金絲桃素、偽金絲桃素在抗抑郁、抗逆轉錄病毒等方面具有較高的開發價值，是鎮定劑、抗炎藥、抗抑郁藥、抗腫瘤及艾滋病等病毒疾病治療藥物，特別是抗抑郁制劑的重要原料[4－6]。貫葉金絲桃的廣泛應用，導致其資源供不應求，民間常用其他類似品種代替，使其藥材品種質量混亂加劇。傳統的性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定在中藥材的物種鑒定上有一定局限性[7]，為了保證中藥材臨床應用準確、安全、有效，對其準確鑒定很有必要。DNA條形碼技術最先由加拿大動物學家Paul Hebert提出，通過測定植物DNA序列進行比較，反映其遺傳差異，以進行物種分類和鑒定[8－10]。ITS2序列是目前首推的作為植物鑒別的DNA條形碼之一，包含豐富的變異位點和信息位點，對植物有較高的鑒別能力[11－12]。有研究表明，核ITS2序列的鑒定能力優于國際條形碼協會植物工作組提出的matK和rbcL組合，首次提出將ITS2作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列[13]。本研究中應用ITS2條形碼序列鑒別貫葉金絲桃及其混偽品，以期為貫葉金絲桃中藥材準確鑒定提供新方法。

1 材料與方法

1．1 材料

收集來自于甘肅地區的貫葉金絲桃及其混偽品90份，另從GenBank中下載3條貫葉金絲桃ITS2條形碼序列，基因登錄號為GQ434761，GU596502和EU796888。樣本信息見表1。

表1 貫葉金絲桃及其混偽品的樣本信息

1．2 方法

1．2．1 DNA 提取和 PCR 擴增

采用北京擎科新業生物技術有限公司植物基因組DNA提取試劑盒（貨號 TSP101）提取貫葉金絲桃及其混偽品的總 DNA。使用植物 ITS2區通用引物(ITS2F： 5′－ATGCGATACTTGGTGTGAAT－3′；ITS2R：5′－GACGCTTCTCCAGACTACAAT －3′)進行 PCR 擴增。

PCR反應體系在200 μL離心管中進行，反應總體積為25 μL，反應體系包括：購自北京擎科新業生物技術有限公司的高保真 PCR反應預混液 I－5TM2×High － Fidelity Master Mix 12．5 μL，ITS2F 1 μL，ITS2R 1 μL，DNA 0．5 μL，ddH2O 10 μL。PCR 反應程序為 98 ℃預變性 2 min，循環反應 35次（98℃ 10 s，56℃ 10 s，72℃ 30 s），72 ℃ 延伸 3 min，8℃ 保存。PCR產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京擎科新業生物技術有限公司進行雙向測序。

1．2．2 數據處理

采用CodonCode Aligner對所得序列峰圖進行校對拼接，去除引物區和低質量的序列，由基于隱馬爾可夫模型(Hmmer)的注釋方法切除ITS2兩端的5．8S和28S區域，獲得標準的ITS2間隔區序列[14]，將獲得的ITS2序列提交到中藥材DNA條形碼鑒定系統(http:／／www．tcmbarcode．cn)或 GenBank 數據庫中應用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進行序列比對。同時將所得ITS2序列利用MEGA 6．0進行多重比對，基于Kimura－2－parameter(K2P)模型計算遺傳距離，并采用鄰接(NJ)法構建系統發育樹(NJ樹)，并進一步預測ITS2二級結構，獲得二級結構預測圖。

2 結果與分析

2．1 DNA提取及PCR擴增結果

本研究中提取樣本的基因組DNA，條帶清晰，無明顯降解，無蛋白和多酚多糖污染，滿足后續擴增試驗要求。貫葉金絲桃及混偽品經PCR擴增后電泳檢測均得到約為700 bp大小的片段。PCR產物雙向測序均獲得成功，經拼接后獲得高質量的序列。

2．3 種內種間變異

貫葉金絲桃種內序列共87條，ITS2序列長度為236 bp，變異位點為3個。種內最大K2P距離為0．004。貫葉金絲桃混偽品共3條序列，分別為36號樣本一年蓬 Erigeron annuu，78號樣本蓍Achillea和90號樣本長柱金絲桃 Hypericum ascyron，ITS2序列長度分別為212，206，230 bp。36號樣本一年蓬 Erigeron annuu與貫葉金絲桃種間最小K2P遺傳距離分布為0．490；78號樣本蓍 Achillea與貫葉金絲桃種間最小K2P遺傳距離分布為0．320；90號樣本長柱金絲桃 Hypericum ascyron與貫葉金絲桃種間最小K2P遺傳距離分布為0．107。

2．4 NJ樹分析

利用MEGA6．0，采用鄰接法，基于本研究中獲得的所有ITS2單倍型序列和GenBank中下載的3條貫葉金絲桃 ITS2條形碼序列，基因登錄號 GQ434761，GU596502和EU796888構建聚類NJ樹(圖 1)。由構建的NJ樹可見，與和GenBank中下載的3條貫葉金絲桃ITS2條形碼序列聚在一大支上的均為真的貫葉金絲桃，而36，78，90這3個樣本的ITS2條形碼序列單獨聚為一支，為貫葉金絲桃偽混品。

2．5 貫葉金絲桃及其混偽品ITS2二級結構預測

根據 http: ／／its2．bioapps．biozentrum．uniwuerzburg．de／所預測的供試樣本的ITS2二級結構結果可見，所有物種的二級結構均為一個中心環及4個螺旋區構成，每個螺旋上又有或多或少的大小不一的莖、環結構。預測GenBank中下載的3條貫葉金絲桃ITS2條形碼序列，以及和這3條序列聚類最近的16，29，81樣本，還有36，78，90這 3個混偽品的 ITS2二級結構。貫葉金絲桃的ITS2序列二級結構為一個中心環（主環），在螺旋Ⅰ區上有4個莖環，在螺旋Ⅱ區有3個莖環，在螺旋Ⅲ區有6個莖環，在螺旋Ⅳ區有2個莖環。而36號樣本一年蓬 Erigeron annuus和78號樣本蓍 Achillea millefolium與貫葉金絲桃ITS2條形碼序列二級結構均有差異。90號樣本長柱金絲桃 Hypericum ascyron與貫葉金絲桃ITS2條形碼序列二級結構的中心主環和Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ個螺旋區有差異。

3 討論

貫葉金絲桃應用廣泛，市場上充斥著各種混偽品，傳統的鑒定方法有其局限性。利用DNA條形碼技術，從分子水平上對其進行準確鑒定很有必要。

理想的DNA條形碼通常需要滿足以下3個標準：物種水平具有顯著的遺傳變異和分化，能鑒別不同物種；合適的長度，便于DNA擴增、測序、拼接及排序時不需要手動調整；目的片段兩端具有保守位點，可用于通用引物設計。ITS2正是具有以上優點被提出作為藥用植物鑒定的標準條形碼序列。同時，作為分子系統進化研究中最重要的標記之一，ITS2序列在物種水平或種下水平具有明顯的序列變異性，其二級結構可提高系統發育樹重建的準確性[13－14]。本研究中針對貫葉金絲桃及混偽品運用ITS2擴增測序均能很好地完成；同時，貫葉金絲桃種內最大K2P遺傳距離為0．004，與其混偽品種間 K2P遺傳距離分布為 0．107～0．490，可見 ITS2條形碼序列在貫葉金絲桃種間變異和分化顯著，能將不同種區分開來。

圖1 基于ITS2條形碼構建的貫葉金絲桃及其混偽品的NJ樹

由NJ樹可知，所有貫葉金絲桃均聚在一大枝上，可將其余混偽品區分。同時，預測貫葉金絲桃及其混偽品ITS2二級結構，發現貫葉金絲桃種類二級結構保守，與其偽混品的ITS2二級結構相比，在螺旋Ⅱ區均相對保守，在Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ螺旋區有差異，進一步提高了系統發育樹重建的準確性。由本研究結果可見，基于ITS2條形碼技術可對貫葉金絲桃原植物及其藥材與混偽品進行準確、快速地鑒定，可作為傳統鑒定方法的補充，為市場上貫葉金絲桃藥用植物的鑒定提供科學依據。

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