PI 3K/AKT信號通路阻斷藥聯合小檗堿對前列腺癌DU145細胞生長的抑制作用

凡治國，李志平，任超

安陽市腫瘤醫院普內科，河南 安陽455000

目前，前列腺癌的治療方式主要有內分泌療法、化療和放療[1-2]。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PⅠ3K/AKT）信號通路與腫瘤的發生、發展密切相關，能夠參與調控腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等多種生物學過程，在腫瘤細胞放療和化療的拮抗中起重要作用[3-4]。小檗堿又名黃連素，是一種季胺型異喹啉類生物堿，主要存在于小檗科、毛莫科黃連屬等植物中。小檗堿具有清熱解毒和消炎的作用，傳統中醫常用于治療胃腸道疾病[5]，其對糖尿病和心血管疾病等也具有較好的療效[6-7]。另外，有研究表明，小檗堿對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用[8]。本研究探討了PⅠ3K抑制藥——LY294002聯合小檗堿對前列腺癌DU145細胞生長的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人前列腺癌DU145細胞購自中國科學院細胞庫，小檗堿、LY294002購自Sigma公司，RPMⅠ1640培養基購自Ⅰnvitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibco公司，PⅠ3K、p-AKT、cyclin D1、bcl-2和BAX單克隆抗體及辣根過氧化物標記的二抗購自美國Abcam公司，MTT試劑盒購自Promega生物技術有限公司，Annexin-V-FⅠTC/PⅠ細胞凋亡檢測試劑盒購自生工生物工程有限公司，RNase A購自Solarbio公司，蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。CO2培養箱、全自動酶標儀購自Thermo Fisher公司，倒置顯微鏡購自日本尼康公司，流式細胞儀購自Beckman Coulter公司，蛋白化學發光凝膠成像系統FluorChem E購自美國Protein Simple公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 從液氮罐中取出裝有前列腺癌DU145細胞的凍存管，放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，待細胞完全溶解后，在超凈臺中用移液槍將細胞轉移至5 ml無菌離心管中，加入含有10%FBS的RPMⅠ1640細胞培養液，離心棄上清。加入新的細胞培養液重懸細胞，接種到細胞培養皿中，置于37℃5%CO2培養箱中培養。待細胞融合度達到80%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化、離心、收集細胞，按1∶4的比例進行傳代培養。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的DU145細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后，加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，計數并調整細胞濃度，以5×105/孔接種于96孔板中，置于37℃5%CO2培養箱中培養24 h后，更換為含小檗堿及LY294002的細胞培養液培養。將細胞分為兩組：小檗堿組，用含小檗堿的細胞培養液單獨處理細胞；小檗堿+LY294002組，用含小檗堿和LY294002的細胞培養液聯合處理細胞。小檗堿組：小檗堿濃度分別為10、20、40、80 μmol/L；小檗堿+LY294002組：10 μmol/L的LY294002分別與10、20、40、80 μmol/L的小檗堿聯合作用；另外，每組均設空白對照（不加藥物處理）。培養48 h后，每個濃度處理組選擇6孔細胞，每孔加入體積分數為0.5%的MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液 150 μl，低速振蕩10 min，待藍紫色結晶完全溶解后，用調零孔調零。采用全自動酶標儀在490 nm波長處測定細胞的OD值，并計算細胞增殖率。細胞增殖率=實驗組細胞OD490/對照組細胞OD490×100%。

1.2.3 Annexin V/PI熒光雙染法檢測細胞凋亡取對數生長期的DU145細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，將細胞濃度調整至1×106/ml，每孔2 ml接種于6孔細胞培養板中，置于37℃5%CO2培養箱中培養24 h，更換為分別含80 μmol/L小檗堿（小檗堿組）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L小檗堿（小檗堿+LY294002組）、不含LY294002和小檗堿（空白對照組）的細胞培養液繼續培養，每組設6個復孔。作用48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化、PBS清洗、離心收集細胞。每孔加入500 μl Binding buffer重懸細胞，將細胞濃度調整至1×106/ml；取1 ml細胞懸液加入10 μl Annexin V-FⅠTC和10 μl碘化丙錠（propidium iodide，PⅠ），室溫避光孵育20 min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 取數生長期的DU145細胞，用含有80 μmol/L小檗堿（小檗堿組）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L小檗堿（小檗堿+LY294002組）及不含LY294002和小檗堿（空白對照組）的細胞培養液分別處理48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。PBS洗滌后，加入體積分數為75%的乙醇，4℃固定過夜。1500 r/min離心5 min，收集細胞，300 μl PBS重懸后，加入150 μl RNase A（10 mg/ml）和50 μl P（Ⅰ1 mg/ml），4℃避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達情況 取對數生長期的DU145細胞，用含有80 μmol/L的小檗堿（小檗堿組）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L 小檗堿（小檗堿+LY294002組）及不含LY294002和小檗堿（空白對照組）的細胞培養液分別處理48 h后，用PBS洗滌細胞2次，0.25%的胰蛋白酶消化細胞，1000 r/min離心5 min收集細胞。加入300 μl細胞裂解液和3 μl蛋白酶抑制藥，冰上裂解30 min，離心取上清。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度，用PBS將各蛋白樣品濃度調至統一后與5×SDS PAGE上樣緩沖液充分混合，100℃煮沸變性5 min。配置8%的SDS蛋白凝膠進行電泳，電泳結束后取出蛋白凝膠，4℃轉印至PVDF膜上，用5%BSA封閉后，TBST洗滌3次，然后依次與一抗（500倍稀釋）、二抗（100倍稀釋）孵育后，滴加化學發光劑ECL顯色，用蛋白化學發光凝膠成像系統采集圖像，分析蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小檗堿單用及與LY294002聯用對DU145細胞增殖的影響

采用MTT法檢測不同濃度的小檗堿單用及與10 μmol/L的LY294002聯用處理DU145細胞48 h后，對細胞增殖的影響，結果顯示：小檗堿組中，10、20、40、80 μmol/L小檗堿分別處理后DU145細胞的增殖率均較空白對照（0 μmol/L小檗堿）低，且隨著小檗堿作用濃度的增加，細胞增殖率逐漸降低，呈劑量依賴性。10、20、40、80 μmol/L小檗堿與10 μmol/L的LY294002聯用后，對DU145細胞增殖的抑制作用較相同濃度小檗堿單獨處理時增強，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 小檗堿單用及與LY294002聯用對DU145細胞增殖的影響

2.2 小檗堿單用及與LY294002聯用對DU145細胞凋亡的影響

采用流式細胞儀檢測80 μmol/L小檗堿單用及與10 μmol/L LY294002聯用處理DU145細胞48 h后，對細胞凋亡的影響，結果顯示：小檗堿組、小檗堿+LY294002組、空白對照組DU145細胞的凋亡率分別為（27.50±1.25）%、（39.47±3.65）%、（7.56±0.51）%。與空白對照組相比，小檗堿組DU145細胞的凋亡率增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。小檗堿與LY294002聯用后，對DU145細胞凋亡的誘導作用明顯增強，與小檗堿組和空白對照組相比，小檗堿+LY294002組DU145細胞的凋亡率增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 小檗堿單用及與LY294002聯用對DU145細胞凋亡的影響

2.3 小檗堿單用及與LY294002聯用對DU145細胞周期的影響

采用流式細胞儀檢測80 μmol/L小檗堿單用及與10 μmol/L LY294002聯用處理DU145細胞48 h后，對DU145細胞周期的影響，結果顯示：與空白對照組相比，小檗堿組的G0/G1期DU145細胞所占比例升高，S期DU145細胞所占比例降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；空白對照組與小檗堿組的G2/M期DU145細胞所占比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。小檗堿與LY294002聯用后，對DU145細胞周期的阻滯作用增強，與小檗堿組和空白對照組相比，小檗堿+LY294002組G0/G1期細胞所占比例升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 小檗堿單用及與LY294002聯用對DU145細胞周期的影響（%，±s）

表1 小檗堿單用及與LY294002聯用對DU145細胞周期的影響（%，±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.05；b與小檗堿單獨處理組比較，P＜0.05

組別空白對照組（n=6）小檗堿組（n=6）小檗堿+LY294002組（n=6）42.31±3.48 61.56±5.21a 74.19±5.69a b 24.48±2.19 20.81±2.94 17.59±2.76 33.21±3.18 17.63±2.51a 8.22±1.98a G0/G1期G2/M期S期b

2.4 小檗堿單用及與LY294002聯用對PI 3 K和p-AKT蛋白表達的影響

采用Western blot檢測DU145細胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表達變化，結果顯示：空白對照組DU145細胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白均呈高表達；小檗堿組DU145細胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表達水平均較空白對照組下調，差異均有統計學意義（P＜0.05）；小檗堿+LY294002組DU145細胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表達水平均較小檗堿組和空白對照組下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖3）

圖3 小檗堿單用及與LY294002聯用對ⅠP 3 K和p-AKT蛋白表達的影響

2.5 小檗堿單用及與LY294002聯用對cyclin D 1、bcl- 2和BAX蛋白表達的影響

采用Western blot檢測DU145細胞中cyclin D1、bcl-2和BAX蛋白表達情況，結果顯示：小檗堿組DU145細胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表達水平均較空白對照組下調，BAX蛋白表達水平均較空白對照組上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與小檗堿組和空白對照組相比，小檗堿+LY294002組DU145細胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表達均下調，BAX蛋白表達上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖 4）

圖4 小檗堿單用及與LY294002聯用對cyclin D 1、bcl- 2和BAX蛋白表達的影響

3 討論

小檗堿是主要存在于小檗科、毛莫科等植物中的季胺型異喹啉類生物堿，具有清熱解毒和消炎的作用，傳統中醫常用于治療胃腸道疾病，能夠通過改善胃腸道微生物菌群結構及減輕炎性反應發揮抗代謝紊亂的作用[9]。近年來研究表明，小檗堿具有抗腫瘤作用，如在宮頸癌中，李娜等[10]研究發現，小檗堿能夠抑制宮頸癌HeLa細胞的體外增殖，減弱細胞的侵襲和轉移能力。溫純潔[11]研究發現，小檗堿可以協同他莫昔芬抑制乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7/TAM細胞增殖，誘導細胞凋亡和細胞G1期阻滯，從而抑制乳腺癌的生長。此外，小檗堿還能在胃癌[12]、肺癌[13]、結腸癌[14]等多種腫瘤中發揮抗腫瘤作用。本實驗以前列腺癌DU145細胞為實驗材料，研究了小檗堿對DU145細胞生長的影響，結果顯示10、20、40、80 μmol/L的小檗堿均能夠抑制DU145細胞增殖，且呈劑量依賴性。進一步用80 μmol/L小檗堿研究其對DU145細胞凋亡的影響，結果顯示小檗堿能夠誘導DU145細胞凋亡，并將細胞阻滯于G0/G1期，說明小檗堿能夠抑制DU145細胞的生長。

已有研究證實多條信號通路參與惡性腫瘤的發生、發展，如MAPK信號通路[15]、JAK/STAT信號通路、NF-κB信號通路[16]等。PⅠ3K/AKT屬于酪蛋白激酶受體型信號轉導通路，近年來研究表明，PⅠ3K/AKT信號通路在細胞的增殖及血管生成中具有重要作用，PⅠ3K/AKT信號通路激活能夠促進細胞的生長、抑制細胞的凋亡，與多種腫瘤的發生相關[17]。相關研究還發現，抑制PⅠ3K/AKT信號通路能夠增強癌細胞對放療及化療的敏感性[18]。本研究采用PⅠ3K抑制藥——LY294002抑制PⅠ3K/AKT信號通路，發現LY294002與小檗堿聯用能夠提高小檗堿對DU145細胞增殖的抑制作用，同時能夠提高DU145細胞的凋亡率及對細胞周期阻滯情況，提示抑制PⅠ3K/AKT信號通路能夠提高小檗堿對前列腺癌的治療效果。本研究還采用Western blot法檢測了DU145細胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白的表達水平，結果顯示，與空白對照組相比，小檗堿能夠抑制PⅠ3K和p-AKT蛋白的表達水平，說明小檗堿能夠抑制PⅠ3K/AKT信號通路的激活；當LY294002與小檗堿聯用后，與小檗堿單獨作用時相比，PⅠ3K和p-AKT蛋白表達水平均下調，表明LY294002能夠增強小檗堿對PⅠ3K/AKT信號通路的抑制作用。

cyclin D1是重要的細胞周期調控因子，目前研究顯示，cyclin D1過表達能夠造成細胞異常增殖及細胞周期調節失控，與多種腫瘤的發生相關[19]。bcl-2基因家族在通過線粒體途徑調控細胞凋亡中具有重要的作用，其中bcl-2的主要功能是抑制細胞凋亡，BAX的主要功能是促進細胞凋亡，bcl-2和BAX能夠形成異源或同源二聚體調節細胞的凋亡[20]。本研究采用Western blot法檢測發現，小檗堿能夠抑制DU145細胞中cyclin D1和bcl-2蛋白的表達，促進BAX蛋白的表達，表明小檗堿影響DU145細胞增殖、凋亡和細胞周期與其能夠調控cyclin D1、bcl-2和BAX蛋白的表達相關。進一步研究發現，當小檗堿與LY294002聯用后，DU145細胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表達均下調，BAX蛋白表達上調，與小檗堿單獨處理時相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，小檗堿能夠抑制DU145細胞增殖，并促進細胞凋亡和細胞周期阻滯，采用LY294002阻斷PⅠ3K/AKT信號通路能夠明顯增強小檗堿對前列腺癌DU145細胞生長的抑制作用。

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