HE 4在上皮性卵巢癌中的表達情況及其與臨床特征及預后的關系分析

黨秋紅，曹靜，張歡歡，曾憲旭，靳耀鋒

1鄭州大學第三附屬醫院病理科，鄭州450052

2西安交通大學第二附屬醫院病理科，西安710004

卵巢癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，且其組織成分復雜，是類型最多的原發性腫瘤，包括上皮性腫瘤、性索/間質腫瘤和生殖細胞腫瘤等，其中上皮性卵巢癌所占比例最大[1]。卵巢癌的發病一般比較隱匿，多數患者確診時已是腫瘤晚期，預后相對較差，故尋找一種可靠的早期診斷方法十分重要[2]。卵巢癌的診斷有多種方法，包括婦科三合診（陰道、直腸及腹部），經陰道多普勒彩色超聲，影像學檢查如CT、MRⅠ、正電子發射斷層掃描（positron emission tomography，PET）等，以及腫瘤標志物檢測如糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）及CA19-9等[3]。其中CA125檢測是卵巢癌最常見的早期篩查方法，尤其是上皮性卵巢癌患者對其更為敏感，但其對組織的特異度相對較差，且對早期腫瘤的敏感度有限，故尋找一種高敏感、高特異度的新型腫瘤標志物是所有婦科腫瘤研究者的重要目標[4]。人附睪上皮分泌蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）是一種分泌型糖蛋白，在各種惡性腫瘤組織中均異常表達，提示其與腫瘤的發生發展有密切的關系[5]。本研究采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELⅠSA）和免疫組織化學法（immunohistochemistry，ⅠHC）檢測卵巢癌組織中HE4的表達情況，分析其與臨床特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年3月至2014年3月于鄭州大學第三附屬醫院診治的150例上皮性卵巢癌患者和72例良性卵巢疾病患者的臨床資料。納入標準：①上皮性卵巢癌患者的臨床表現和病理學檢查結果均符合上皮性卵巢癌的診斷（依據《婦產科學》第7版[6]）；②上皮性卵巢癌患者均于鄭州大學第三附屬醫院首診，且術前未經任何放化療；③病歷資料完整。排除標準：①依從性差；②放化療過敏；③有手術絕對禁忌證。150例上皮性卵巢癌患者的年齡為24～68歲，平均為（42.32±9.05）歲；依據1988年國際婦產科聯盟（FⅠGO）分期標準[7]，病理分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期72例。72例良性卵巢疾病患者的年齡為22～65歲，平均為（41.73±9.79）歲。兩組患者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 檢測方法

HE4兔抗人單克隆抗體（一抗）購于美國Abcam公司，抗兔抗體（二抗）和DAB酶底物顯色劑購于美國Dako公司，HE4 ELⅠSA試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司。

1.2.1 ELISA法檢測血清HE 4水平 收集治療前后上皮性卵巢癌和良性卵巢疾病患者的空腹靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，3000 r/min離心5 min，取上清。然后采用ELⅠSA法檢測兩組患者的血清HE4水平，所有操作均嚴格按照試劑盒操作說明書進行。

1.2.2 IHC法檢測腫瘤組織中HE 4表達情況 ⅠHC的原理是一種抗原抗體反應，可用于蛋白的定位、定性及相對定量的研究，該技術被廣泛應用于腫瘤診斷，是發現腫瘤最新蛋白最實際的“金標準”。本研究采用ⅠHC法檢測HE4在150例上皮性卵巢癌患者的癌組織和相應癌旁正常組織中的表達情況，具體步驟如下：①烤片，常規石蠟切片，切片厚度為3～5μm，60℃烤片3～4 h。②脫蠟入水，二甲苯脫蠟2遍，各10 min；梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）脫二甲苯入水，各3 min；蒸餾水洗3遍，各3 min。③內源性過氧化物酶阻斷，H2O2加甲醇，10 min，注意避光。④抗原修復，玻片標本置于盛有檸檬酸修復液的高壓鍋中，電磁爐加熱至沸騰，改檔并保持在130 kW，15 min，然后自然冷卻至常溫，30～40 min；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗3遍，各3 min。⑤添加一抗，滴加兔抗人HE4多克隆抗體（一抗）（1∶100稀釋），4℃濕盒內過夜；PBS洗3遍，各4 min。⑥添加二抗，37 ℃濕盒內孵育15～20 min；PBS洗3遍，各4 min。⑦二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，添加DAB酶底物顯色劑，顯微鏡下觀察，控制顯色反應1 min左右，蒸餾水洗2遍，各4 min。⑧蘇木素復染、封片，將玻片置于蘇木素染色液進行復染1 min（每次需要將漂浮的氧化膜去掉），然后用流水沖洗5～7 min，再放入梯度乙醇（95%、85%、75%）中各1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。

HE4蛋白陽性表達為細胞質呈黃色或棕黃色。判定方法采用雙盲法[8]：染色強度×陽性細胞百分比。在同一個物鏡視野下，一位病理科高級職稱醫師負責染色強度判斷：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；另一位病理科高級職稱醫師負責陽性細胞計數：未見陽性細胞為0分，陽性細胞占所有細胞百分比≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度×陽性細胞百分比≥3分為HE4蛋白陽性表達。

1.3 隨訪方法

上皮性卵巢癌患者的隨訪時間截至患者死亡或2017年3月，隨訪時間為36個月，隨訪方式包括電話隨訪、上門隨訪和門診復診等，了解患者的生存情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析或SNK-q檢驗；計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；繪制生存曲線采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Logrank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清HE 4水平

Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌患者的血清HE4平均水平分別為（216.93±57.39）、（245.19±63.28）pmol/L，均明顯高于良性卵巢疾病患者的（164.06±50.17）pmol/L，差異均有統計學意義（P＜0.01）；且Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌患者的血清HE4平均水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 HE 4蛋白的表達情況

上皮性卵巢癌患者的癌組織中HE4蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 上皮性卵巢癌患者的癌組織與相應癌旁正常組織中HE 4蛋白陽性表達率的比較

2.3 上皮性卵巢癌組織HE 4蛋白表達與臨床特征的關系

腫瘤直徑＞3 cm、低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的上皮性卵巢癌組織HE4蛋白的陽性表達率分別高于腫瘤直徑≤3 cm、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的癌組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的上皮性卵巢癌患者HE 4蛋白的陽性表達率的比較

2.4 上皮性卵巢癌患者的HE 4蛋白表達與生存情況的關系

隨訪36個月，HE4蛋白陽性表達的上皮性卵巢癌患者的生存率為22.08%，低于陰性表達患者的 60.17%，差異有統計學意 義（χ2=7.946，P=0.028）。（圖1）

3 討論

圖1 HE 4陽性、陰性表達的上皮性卵巢癌患者的生存曲線圖

HE4蛋白是WFDC2基因的產物，該基因位于染色體20q12-13.1上，屬于WAP家族。近年，有研究顯示HE4在早、晚期卵巢癌患者的診斷和鑒別診斷中具有較高的特異度和靈敏度[9]。Moore等[10]發現，HE4在早期卵巢癌診斷和鑒別診斷中的靈敏度優于CA125，與其他腫瘤標志物比較，HE4蛋白是最佳的單項檢測指標，但若其與其他標志物（CA125最佳）聯合，卵巢癌診斷的敏感度和特異度最高。有研究證明，HE4在卵巢癌組織中特異度高，良性卵巢組織中低，且與臨床特征及預后有密切的關系，有望成為早期診斷和監測卵巢癌預后的重要指標[11]。本研究中，上皮性卵巢癌患者的血清HE4水平明顯高于良性卵巢疾病患者，上皮性卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期患者的血清HE4水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05），說明HE4不僅可鑒別良性卵巢疾病與上皮性卵巢癌，還可較好地反映腫瘤的發展趨勢。本研究還發現，HE4表達情況與腫瘤直徑、分化程度、FⅠGO分期及有無淋巴結轉移有關（P＜0.05），說明HE4表達與腫瘤的惡性程度、轉移有關，這與莊慧宇等[12]的研究結果基本一致，提示HE4有望成為上皮性卵巢癌患者早期診斷、個體化治療的重要指標。此外，本研究還發現，HE4蛋白陽性表達的上皮性卵巢癌患者的生存率低于陰性表達的患者，差異有統計學意義（P＜0.05），這與王靜等[13]的研究結果基本一致，提示HE4在監測上皮性卵巢癌的預后方面有一定的研究意義。綜上所述，HE4是上皮性卵巢癌的良好腫瘤標志物，與腫瘤的良、惡性及臨床特征有密切的關系，對上皮性卵巢癌患者的早期診斷及預后有一定的價值。

[1]楊念念,嚴亞瓊,鄭榮壽,等.中國2009年卵巢癌發病與死亡分析[J].中國腫瘤,2013,22(8):617-621.

[2]韓瑛,李淑敏.分子診斷技術在卵巢癌個體化診治中應用的現狀與進展[J].癌癥進展,2015,13(1):14-18.

[3]Davidson B,Tropé CG.Ovarian cancer:diagnostic,biological and prognostic aspects[J].Womens Health(Lond),2014,10(5):519-533.

[4]葉敏,唐均英.血清CA125及HE4診斷卵巢癌的研究進展[J].現代婦產科進展,2013,22(6):496-498.

[5]Galgano MT,Hampton GM,Frierson FH Jr.Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues[J].Mod Pathol,2006,19(6):847-853.

[6]樂杰.婦產科學[J].7版.北京:人民衛生出版社,2008.

[7]程峰,朱筧青.卵巢癌減瘤術結局及病理分期與術前血細胞計數的關系[J].中國醫師雜志,2017,19(1):83-85.

[8]劉勇,楊海玉.國際特設專家委員會建議:診斷免疫組化陽性對照標準化[J].臨床與實驗病理學雜志,2016,32(1):1-3.

[9]鄒姝麗,崔恒.人附睪分泌蛋白4在卵巢癌診斷中的應用[J].中國實用婦科與產科雜志,2011,27(1):66-69.

[10]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al.The use of multiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvic mass[J].Gynecol Oncol,2008,108(2):402-408.

[11]肖林,郭梅,李鳳煥,等.聯合應用人附睪蛋白4與卵巢惡性腫瘤風險算法診斷卵巢癌的研究進展[J].海南醫學,2016,27(14):2341-2343.

[12]莊慧宇,胡珍華,劉娟娟,等.HE4與Lewis在卵巢上皮性腫瘤中的表達及相關性研究[J].現代腫瘤醫學,2015,23(11):1570-1575.

[13]王靜,羅晨輝,王瑛,等.eⅠF3a和HE4表達與卵巢癌的相關性[J].中南大學學報(醫學版),2014,39(12):1240-1245.