離子交換層析法測量糖化血紅蛋白的不確定度評定及應(yīng)用

刁奇志 黃利君 莫展 曾強 汪開華

[摘要] 目的 評定離子交換層析法測量糖化血紅蛋白（HbA1c）不確定度，以此為例探討不確定度在臨床診療上的應(yīng)用價值。 方法 從分析前、分析中、生理變異及其他疾病影響因素等各個環(huán)節(jié)梳理離子交換層析法測量HbA1c的不確定度來源，合成、計算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴展不確定度；舉例探討HbA1c不確定度在臨床診療上的應(yīng)用。 結(jié)果 分析中的不精密度、系統(tǒng)誤差、校準(zhǔn)品不確定度、校準(zhǔn)品復(fù)溶產(chǎn)生的誤差、為HbA1c測量不確定度的主要來源，而分析前因素可通過分析前質(zhì)量控制加以控制，生理變異及其他疾病影響因素僅針對個別群體，不具有普遍性因此均可以不予考慮。5.11及10.04兩個室內(nèi)質(zhì)控水平的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為6.33%、4.54%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.32%、0.46%，擴展不確定度分別為0.64%、0.92%。在5.11%和10.04%附近水平的同一患者前后兩次測量結(jié)果差值分別大于0.45%、0.41%，結(jié)果才具有顯著性意義。考慮到測量不確定度，HbA1c<5.86%，可排除患糖尿病的可能，HbA1c>7.14%可確診糖尿病，HbA1c值位于5.86%及7.14%之間，不能確定是否患有糖尿病，需進一步檢查確診。 結(jié)論 測量的不精密度、系統(tǒng)誤差、校準(zhǔn)品賦值的不確定度、校準(zhǔn)品復(fù)溶產(chǎn)生的誤差是離子交換層析法測量HbA1c的不確定度主要來源，不確定度在疾病的診斷、療效評估方面有重要意義。

[關(guān)鍵詞] 糖化血紅蛋白；離子交換層析法；不確定度；評定與應(yīng)用

[中圖分類號] R576.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（a）-0131-04

[Abstract] Objective To evaluate the uncertainty of glycosylated hemoglobin （HbA1c） measuredby ion-exchange chromatography， and todiscussthe application value of uncertainty in clinical diagnosis and treatment. Methods The source of uncertainty were combed from pre-analysis， analytical phase， physiological variation， some diseases influence factors， and so on. Then the standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated and the clinical applications of uncertainty in clinical diagnosis and treatmentwere illustrated. Results The main source of the uncertainty on HbA1c measured by ion exchange chromatography were imprecision， systematic error， the uncertainty of calibration product and errors caused by calibration product redissolved during measurement. The pre-analysis factors could be controlled by pre-analysis quality control. Physiological variation and other disease affecting factors wereonly related to some individuals without universality， which could not taken into consideration. The relative standard uncertainties of the internal quality control concentrationsin 5.11% and 10.04% were 6.33% and 4.54% respectively， the standard uncertainties were 0.32% and 0.46% respectively and the expanded uncertainty were 0.64% and 0.92% respectively. Two HbA1c measurements near by 5.11%， 10.04% for respectively. Taking the uncertainty into consideration， the possibility of suffering from diabetes could be excluded when HbA1c concentration of patient <5.86%， in addition diabetes could be diagnosed when HbA1c>7.14%. While patientscould not be determined whether suffering from diabetes when HbA1c value is located between 5.86% and 7.14%， which needed further examination to confirm. Conclusion The main source of the uncertainty on HbA1c measurement by ion exchange chromatography are measurement imprecision， systematic error， the uncertainty of calibrator productand the errors caused by calibrator product redissolving. The uncertainty is significant to diagnose clinical diseases and evaluate curative effect.

[Key words] Glycosylated hemoglobin； Ion exchange chromatography； Uncertainty； Evaluation and application value

目前，全世界糖尿病患者為2億人，我國糖尿病也達到了4千萬人，隨著生活水平的提高，工作節(jié)奏的加強及運動逐漸減少，糖尿病患病率還在不斷上升。糖尿病已成為世界上僅次于心血管、癌癥的第三大死亡原因。糖尿病患者多死于并發(fā)癥，因此監(jiān)控糖尿病患者血糖水平對于預(yù)防或減緩并發(fā)癥的發(fā)生至關(guān)重要。而糖化血紅蛋白（HbA1c）是血紅蛋白糖基化不可逆反應(yīng)，反映的是2～3個月的血糖平均水平，其檢測亦不受是否空腹的影響[1]。目前，已被國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（IFCC）作為診斷糖尿病、監(jiān)控血糖水平、評價糖尿病療效的重要指標(biāo)[2-4]。因此，HbA1c測量結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響到糖尿病的診斷與治療。誤差是測量值與被測量物真值的差值，分為隨機誤差及系統(tǒng)誤差，但真值無法知道，因此誤差也不會精確計算[5]。近年來，計量學(xué)引入不確定度。通俗來說，不確定度與測量值一起表征測量真值在一定包含概率，位于一定的包含區(qū)間，其大小代表測量結(jié)果的可疑程度[6]。離子交換層析法作為IFCC推薦的測量HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)方法，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，但國內(nèi)外鮮有關(guān)于其不確定度的評定以及不確定度在臨床上應(yīng)用的報道，因此對此進行探討、研究對糖尿病的診療具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器為日本TOSOH公司C723-G8。室內(nèi)質(zhì)控物及校準(zhǔn)品均為日本東曹（上海）公司提供。室內(nèi)質(zhì)控品分為5.11%、10.04%兩個水平，校準(zhǔn)品分為5.97%、10.99%兩種水平。

1.2 不確定度評估方法

1.2.1 采用分析離子交換層析法測量HbA1c不確定度的來源

分析前、分析中都會給測量帶來不確定度。分析前引入不確定度的環(huán)節(jié)包括標(biāo)本保存條件、運送時間以及患者的準(zhǔn)備情況等，但很難進行評估，可通過分析前質(zhì)量控制來降低。分析中的測量的重復(fù)性、校準(zhǔn)品的賦值、校準(zhǔn)品復(fù)溶以及測量系統(tǒng)偏倚也都會引入不確定度，此外患者生理變異或并發(fā)其他疾病等影響因素也會引入不確定度，但其僅針對個體或某個人群，不具備普遍性[7]。因此，本研究從測量重復(fù)性、校準(zhǔn)品復(fù)溶、校準(zhǔn)品賦值以及測量偏倚這幾個方面評定離子交換層析法測量HbA1c的不確定度[8-9]。

1.2.2 不確定度評定

1.2.2.1 A類不確定的評定 A類不確定度是從一系列觀測值統(tǒng)計分析評價的不確定度分量[10]，分析中不精密度引入的不確定度屬于A類不確定度。采用對兩個水平的室內(nèi)質(zhì)控品分別在1 d內(nèi)測量一批，一批測量20次，統(tǒng)計所得的CV%作為批內(nèi)不精密度。我室室內(nèi)質(zhì)控每月的CV%值可作為日間不精密度。

1.2.2.2 B類不確定的評定 B類不確定度是用不同于觀測值進行統(tǒng)計分析的方法來評定不確定度分量[10]，與室內(nèi)質(zhì)控品濃度相近的衛(wèi)生部室間質(zhì)評兩個水平（5.11%、10.04%）的偏倚、校準(zhǔn)品的不確定度以及校準(zhǔn)品復(fù)溶產(chǎn)生誤差都是B類不確定的評定來源。

1.2.3 不確定度計算公式

標(biāo)準(zhǔn)不確定度=-相應(yīng)濃度水平×相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度=K標(biāo)準(zhǔn)不確定度，K常取2。

1.3 不確定度的臨床應(yīng)用[11]

1.3.1 判斷同一患者前后測量結(jié)果的差異性，擬評估療效或判斷測量結(jié)果的準(zhǔn)確性

僅同一患者前后兩次測量值差值≥uΔ，2次結(jié)果差異才有顯著性意義，證明臨床療效顯著或其中一次的測量結(jié)果不準(zhǔn)確。

1.3.2 幫助確診醫(yī)學(xué)決定水平附近測量值的患者是否患有某種疾病

測量結(jié)果及其擴展相對不確定度差值高于糖尿病的醫(yī)學(xué)決定水平可考慮診斷為糖尿病，低于則可基本排除糖尿病。

2 結(jié)果

2.1 A類不確定度評定

2.1.1 不精密度引入的不確定度

兩個室內(nèi)質(zhì)控水平的批內(nèi)及日間不精密度見表1。

2.1.2 校準(zhǔn)品復(fù)溶吸量產(chǎn)生的誤差引入的不確定度

校準(zhǔn)品復(fù)溶采用5 mL液管吸取4 mL蒸餾水進行復(fù)溶，根據(jù)《中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程》（JJG646-2006）[12]，校準(zhǔn)品復(fù)溶的最大允許誤差為2.5%。

2.2 B類不確定度分量評定

校準(zhǔn)品不確定度分量來源于東曹公司的校準(zhǔn)品溯源性報告。見表2。

2.3 系統(tǒng)偏倚評定

獲取2016、2017年實驗室參加衛(wèi)生部室間質(zhì)評回報數(shù)據(jù)，根據(jù)《臨床檢驗方法評價》[13]公式計算實驗室系統(tǒng)偏倚。見表3。

2.4 合成不確定度按照公式計算

當(dāng)HbA1c=5.11%時，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.932+2.52+5.552+1.402=6.33%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為5.11%×6.33%=0.32%，取k=2，擴展不確定度=0.32%×2=0.64%；同理計算，當(dāng)HbA1c=10.04%時，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.54%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度=10.04%×4.54%=0.46%，擴展不確定度=0.46%×2=0.92%。

2.5 不確定度臨床應(yīng)用

2.5.1 判斷同一患者最近兩次測量結(jié)果是否差異顯著方面的應(yīng)用

5.11%附近的測量值的uΔ=+0.32%2=0.65%，故僅兩次結(jié)果差值大于0.65%，差異存在顯著性意義。以此計算，只有10.04%附近的兩次測量值差值大于0.41%，差異有顯著性意義。其他測量值以此類推。

2.5.2 根據(jù)HbA1c測量值診斷糖尿病方面的應(yīng)用

2010年美國糖尿病協(xié)會推薦6.5%作為HbA1c診斷糖尿病的醫(yī)學(xué)決定水平[14]。在本實驗系統(tǒng)中，HbA1c測量值<5.86%（醫(yī)學(xué)決定水平擴展不確定度=6.5%），可考慮排除糖尿病，>7.14%（6.5%）結(jié)合臨床癥狀可考慮診斷糖尿病，在5.86%～7.14%間，尚不能診斷或排除糖尿病，需進一步做糖耐量檢測。例如某患者空腹血糖測量值為6.61%，略高于HbA1c醫(yī)學(xué)決定水平6.5%[14]，如不考慮不確定度，可能會誤診為糖尿病，但考慮到測量不確定度，其測量真值在95%的包含概率分布在5.97%～7.25%范圍間（標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.09%），因此該患者HbA1c測量真值有可能低于美國糖尿病協(xié)會推薦的診斷糖尿病醫(yī)學(xué)決定水平（6.5%），亦有可能高于醫(yī)學(xué)決定水平，此時尚不能確診該患者為糖尿病，需進一步做糖耐量實驗結(jié)合臨床癥狀確診。

3 討論

分析前、分析中每一個環(huán)節(jié)都可以導(dǎo)致測量誤差，引入不確定度，此外受試對象的生理變異及其他一些影響測量準(zhǔn)確性的疾病也可引入不確定度，據(jù)報道，尿毒癥、血紅蛋白變異體，HbA1c氨甲酰化（尿毒癥）及乙酰化，HbA1c代謝周期異常以及HbA1c前體都會影響離子交換層析法測量HbA1c正確度[15-16]。但這些疾病因素僅針對某種單一群體，不具有普遍性，因此本研究在不確定度評估時可不予考慮。

影響測量準(zhǔn)確性的分析前因素常包括被測量者狀態(tài)，標(biāo)本采集、運送條件、運送時間、保存條件及時間等，因HbA1c代表的是患者2～3個月的血糖平均水平，其檢測不受采集時患者是否空腹、是否使用胰島素或服用降糖藥物等因素的影響，因此患者采集時狀態(tài)對測量結(jié)果不會產(chǎn)生影響，可不予考慮。此外，對于上述分析前因素引入的不確定度可通過制定標(biāo)本采集手冊，對護理及運送護工進行嚴(yán)格的培訓(xùn)，制定不合格標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)并嚴(yán)格執(zhí)行，定期反饋不合格標(biāo)本率，持續(xù)改進標(biāo)本合格率等一系列措施，將因采集、保存、運輸?shù)确治銮耙蛩匾氲牟淮_定度控制在≤1/5最大不確定度分量范圍內(nèi)，可忽略[13]。縱觀分析中全過程，存在校準(zhǔn)品復(fù)溶、校準(zhǔn)、吸樣、測量等過程，校準(zhǔn)品復(fù)溶時吸取蒸餾水的準(zhǔn)確性、校準(zhǔn)品賦值的準(zhǔn)確度以及校準(zhǔn)品復(fù)溶后吸量誤差也都直接影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此這些因素也應(yīng)納入不確定度評定來源，而校準(zhǔn)品賦值的準(zhǔn)確度以校準(zhǔn)品不確定度體現(xiàn)出來。分析中的其他不確定分量諸如吸樣是否精準(zhǔn)、層析柱的洗脫等因素最終是以不精密度及不正確度的方式表現(xiàn)出來。因此分析中的不確定度評定主要應(yīng)從校準(zhǔn)品不確定度、分析中不精密度、分析結(jié)果不正確度3個大的方面進行評估。此次評定中把批內(nèi)及日間不精密度作為A類不確定度來源，日間不精密度數(shù)據(jù)來源于我們實驗室室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)；室間質(zhì)評結(jié)果偏倚體現(xiàn)的是檢測系統(tǒng)的不正確度，因此引用我室參加衛(wèi)生部室間質(zhì)評的偏倚作為B類不確定度分量進行評定，校準(zhǔn)品不確定度來源于校準(zhǔn)品生產(chǎn)廠家資料，因此，亦應(yīng)作為B類不確定度進行評定。

由于參考范圍和醫(yī)學(xué)決定水平不存在不確定度，而測量結(jié)果存在不確定度，因此在診斷疾病時，不考慮測量值的不確定度，把測量結(jié)果直接與參考范圍或醫(yī)學(xué)決定水平進行比較，來確診某種疾病，有一定誤診的風(fēng)險。測量結(jié)果與不確定度一起表達表征實驗真值的分布范圍，因此科學(xué)的比較方法應(yīng)考慮測量結(jié)果的不確定度。在本研究HbA1c測量值不確定度的應(yīng)用示例中可知如不考慮不確定度，就會導(dǎo)致醫(yī)生的誤診。此外，臨床醫(yī)師經(jīng)常會比較同一患者最近兩次測量結(jié)果，卻難以判斷兩個測量值差異的顯著性，也無法推斷兩次測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，特別是在治療過程中難以通過兩次測量結(jié)果來評價療效，但引入不確定度后，此問題就很容易地解決了。因此，不確定度的引入對檢驗科加強與臨床溝通，幫助臨床醫(yī)生診斷疾病、評估療效及患者病情變化有重要意義。

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