青稞酒曲微生物多樣性分析及米根霉制曲條件優化

袁亦舟，張偉國，徐建中

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

青稞酒是西藏地區的特色飲品，因西藏所具有的特殊地理因素和人文因素賦予了青稞酒獨特的口感[1]。曲為酒之骨，曲菌的繁殖和產酶將淀粉、蛋白質等分解，產生葡萄糖、氨基酸等營養物質和有機酸、高級醇等風味物質，對酒的品質和出酒率都有極大的影響[2]。對酒曲中的微生物進行分析，對于篩選功能微生物，實現青稞酒的工業化生產有重要的意義。

最初研究酒曲中微生物的方法是傳統的實驗室分離培養法。然而，酒曲中除了可培養的微生物之外，還存在著大量實驗室無法培養的微生物，單純依靠分離培養法不能反映出酒曲中真實的微生物菌群。近年來分子生物技術成為研究微生物多樣性的新的工具，但傳統的微生物分離培養法仍然是分離獲得優勢菌種的重要方法[3]。雖然克隆文庫和聚丙烯酰胺凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)推動了微生物生態學的研究，但有其局限性，如檢測線低、工作量大等[4-5]。新一代的高通量測序技術可以直接測序復雜環境總DNA的PCR產物，該方法擁有成本低、通量高、準確性高、可以雙向測序等優點，可以快速簡便地分析復雜環境中的微生物組成[6-8]。由于酒曲中存在大量不可培養的微生物，而高通量測序技術規避了實驗室培養這一步驟，直接提取酒曲中的總DNA進行分析，故相比實驗室分離培養法更能體現出微生物的多樣性，同時直接對DNA的PCR產物進行分析，與克隆文庫和聚丙烯酰胺凝膠電泳法相比減少了實驗步驟，數據覆蓋面更大，因此高通量測序技術能夠較為全面和準確地反映土壤微生物群落結構[9]。

傳統制曲工藝中自然培養的方法導致曲中微生物群落復雜，同時制曲條件不易控制，產品質量參差不齊,故多采用純種曲的方法，例如，黃酒生產工藝采用米曲霉蘇-16制備熟麥曲[10]，醬油制曲使用米曲霉滬釀3.042菌種[11]，均實現了工業化生產。分離酒曲中的優質菌株，嚴格控制條件制作的純種曲的質量更為穩定，并且與傳統曲相比具有更高的糖化力和液化力[10， 12]。

本實驗結合分離培養和高通量測序手段探究青稞酒酒曲中微生物群落，同時分離出在發酵中起主要作用的菌株制取純種曲來提高酒曲的糖化力和液化力，為青稞酒的工業化發酵生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

青稞及酒曲：購自西藏圣禾生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

溶菌酶、溶壁酶、蛋白酶K，TIANGEN公司;E.Z.N.A.Soil DNA Kit、玻璃珠，Sigma公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒，Life公司；TaqDNA Polymerase，Thermo公司；Agencourt AMPure XP，Beckman公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

YPD培養基(g/L)：葡萄糖 10，酵母膏 10，蛋白胨 20，瓊脂粉 15。

PDA培養基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用8層紗布過濾，加熱，再據實際實驗需要加15～20 g瓊脂，繼續加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補足水分至1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂15～20。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機，Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器，深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統，美國UVP；Q32866 Qubit?2.0熒光計，Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler PCR儀，BIO-RAD公司；Research plus 0.5-10 μl移液器，Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗室平板分離酒曲微生物

稱取酒曲1 g，加入10 mL的無菌水，充分振蕩混勻，取上清液稀釋，涂布于3種培養基上，在30 ℃的條件下培養。

1.3.2 酒曲中優勢菌株的分離與鑒定

根據菌落形態分離單菌落，提取單菌落基因組后擴增ITS1-4區并測序，將測序結果在NCBI(National center for Biotechnology Information)中進行BLAST比對，數據庫選擇Nucleotide collection(nr/nt)。根據測序結果，找到序列相似度最高的菌種。

1.3.3 基因組DNA的提取方法

參考閆亮珍[13]等利用物理化學法提取酒醅中總DNA的方法。

1.3.4 PCR擴增及高通量測序

提取青稞酒曲總DNA，利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。

真菌高通量測序選用ITS1-2通用引物，細菌高通量測序選用16sV3-V4區通用引物[14]。所得基因片段經純化回收后由生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量測序。實驗中用到的引物見表1。

表1 本研究使用的引物Table 1 The oligonucleotides used in this study

1.3.5 序列數據處理與分析

通過barcode區分樣品序列，并對各樣本序列做QC并去除非特異性擴增序列及嵌合體[15]。

對OTU(operational taxonomic unit)進行聚類分析，將多條序列根據其序列之間的距離來對它們進行聚類，后根據序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元(OTU)；在OTU聚類結果的基礎上，獲取每1個OTU聚類中的代表性序列，選擇豐度最高的序列作為代表性序列，獲取物種在各個分類水平上的群落結果，并計算ACE、Chao、Shannon、Simpson、Coverage等物種多樣性指數[16]。

1.4 純種曲的工藝優化及分析

1.4.1 純種種曲和生產曲的制作工藝[17]

將酒曲中的優勢根霉分離純化，轉接到PDA培養基上，30 ℃下培養至產生較多的孢子；按照工藝流程制作種曲和生產曲(圖1)。

圖1 制曲工藝流程Fig.1 The process of Koji-making

1.4.2 制曲工藝的單因素實驗

(1)不同原料對生產曲質量的影響

以麩皮與青稞作為原材料制曲，青稞與麩皮用粉碎機粉碎，過20目篩，分別用青稞、麩皮、青稞與麩皮比例1∶2、青稞與麩皮比例1∶1、青稞與麩皮比例2∶1為原料制曲，測定糖化力與液化力。

(2)培養時間對生產曲質量的影響

在培養12、24、36、48、60、72、84、96 h時取樣測定糖化酶和液化酶的活力，確定最佳培養時間。

(3)料水比對生產曲質量的影響

按原料質量的30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的比例拌水，優化不同料水比的制曲條件。

(4)溫度對生產曲質量的影響

培養溫度設定為24、26、28、30、32、34 ℃，優化培養溫度。

(5)不同接種量對生產曲質量的影響

接種量設定為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，確定最佳接種量。

1.4.3 酒曲糖化力和液化力的測定[18]

糖化酶活力定義為在35 ℃、pH 4.6條件下，1.0 g干曲1 h水解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U/g)。

液化酶活力定義為在35 ℃、pH 4.6條件下，1.0 g干曲在1 h液化1 g可溶性淀粉所需的酶量為1個酶活力單位(U/g)。

液化液與碘液混合呈無色后為反應終點。

2 結果與分析

2.1 平板分離結果

利用培養基分離酒曲中的微生物(表2)，獲得4株不同形態的菌株；根據菌落特征認為獲得2株霉菌，命名為M1、M2，2株酵母菌，命名為S1、S2。

表2 不同培養基分離結果Table 2 The result of the isolated strains in differentmediums

4種菌株分離純化后提取基因組，利用真菌通用引物ITS1-ITS4進行PCR擴增，獲得的PCR產物測序后進行BLAST比對(表3)，由結果可知分離培養法只能獲得較少種類的微生物，不能準確反映酒曲中的微生物群落。

表3 分離真菌的序列比對和統計結果Table 3 Identification and statistics of fungal strains

2.2 真菌及細菌高通量測序結果

2.2.1 數據預處理

通過barcode區分樣品序列，并對各樣本序列做QC，之后去除非特異性擴增序列及嵌合體，得到個樣本有效數據(表4)。最終真菌多樣性分析獲得27 641個有效序列，細菌多樣性分析獲得20 868個有效序列。

表4 各樣本數據信息統計Table 4 Statistics of samples data

2.2.2 OTU聚類分析

將多條序列根據其序列之間的距離來對它們進行聚類，后根據序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元 (OTU) ，在OTU聚類結果的基礎上，獲取每1個OTU聚類中的代表性序列。選擇豐度最高的序列作為代表性序列，選取similarity為0.97時OTU的聚類數目，已基本覆蓋了測序的全部結果，獲得真菌OTU聚類316個，細菌OTU聚類1 434個。

2.2.3 多樣性指數分析及物種分類學分析

群落生態學中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Chao、Ace是用來估計群落中OTU數目的指數，Shannon、Simpson用來估算樣品中微生物多樣性指數，Shannon值越大，Simpson值越小，代表菌落多樣性越高，Coverage代表各樣品文庫的覆蓋率。由表5可知真菌OTU數目小于細菌，物種多樣性低于細菌；Coverage值說明本次測序結果基本可以代表樣品的真實情況。

表5 多樣性指數的統計結果Table 5 The result of community richness and community diversity

為了得到每個OTU對應的物種分類信息，需要對OTU進行物種分類，采用Na?ve Bayesian assignment算法對每條序列在不同層級水平上計算其分配到此rank中的概率值。一般認為概率值(即RDP分類閾值)大于0.8時此分類結果可信。對酒曲真菌及細菌中各物種在屬的分類水平上的相對豐度進行統計，結果見圖2和圖3。

圖2 真菌屬水平物種分類豐度單樣本柱狀圖Fig.2 Relative abundance of Qu fungi in genus levels

圖3 細菌屬水平物種分類豐度單樣本柱狀圖Fig.3 Relative abundance of Qu bacteria in genus levels注：屬水平下，樣本物種分類中豐度占比最高的前50個物種分類的分布情況，并按照總體豐度從大到小排序。總體豐度指的是，在所有樣本中物種分類reads num的總值。顯示前50個物種分類，剩余物種分類合并成other。

從結果上看，酒曲中真菌的多樣性小于細菌，同時優勢菌株相對集中；根霉屬(Rhizopus)為優勢菌種，相對豐度為42.0%，曲霉屬(Aspergillus)相對豐度值為16.4%，線蟲草屬(Ophiocordyceps)相對豐度值為0.54%，酵母屬(Saccharomyces)相對豐度值為0.52%，其余測序結果相對豐度值小于0.1%。真菌中優勢菌株為根霉屬和曲霉屬，同時也有相當一部分未知的微生物，說明主要起到糖化作用的菌株為根霉和曲霉。細菌中庫克菌屬(Kocuria)相對豐度值為6.0%；球菌屬(Macrococcus)相對豐度值為4.3%；芽孢桿菌屬(Bacillus)相對豐度值為3.9%；微球菌屬(Micrococcus)相對豐度值為3.7%；金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、短桿菌屬(Brachybacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、厭氧芽胞桿菌(Anoxybacillus)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、寡養食單胞菌(Stenotrophomonas)相對豐度值相近，在1.1%～1.5%之間，說明不考慮未知細菌，但從豐度上來看細菌菌株分布沒有明顯的優勢菌株，分布廣且種類眾多，說明細菌在青稞酒的釀造過程可能中主要起到豐富青稞酒風味的作用。

由于高通量測序的數據庫不完整，故在高通量測序中對獲得的OTU數目超過200的代表性序列在NCBI中進行比對，結果如表6和表7所示。在NCBI的比對結果中，細菌中的未知菌較多；真菌中米根霉豐度最高，與平板分離結果相一致，但釀酒酵母豐度較小，OTU數目為140并可以用平板分離出來，說明一些菌種即使在酒曲中有較高的豐度也較難用純培養方法分離。

表6 真菌序列NCBI比對結果Table 6 Identification and statistics of fungal strainsin NCBI

2.3 酒曲單因素優化實驗

2.3.1 原料比

以青稞粉和麩皮為原料制曲，單純利用麩皮制曲會導致霉菌生長不良，麩皮難以保證營養物質的供應，單獨利用青稞粉會導致加水潤料時青稞粉結塊，內部沒有空氣使得原料利用率低，故將麩皮與青稞粉混合并選取適合的比例，能夠在滿足米根霉生長需要的同時提高液化糖化酶活力。由圖4可知在麩皮與青稞的比例是2∶1時酶活性最高，這是由于再加水潤料時青稞粉形成大小合適的小團分布在麩皮之中，合適的比例使得曲的結構蓬松，可以提供充足的氧氣。

表7 細菌序列NCBI比對結果Table 7 Identification and statistics of bacteria strainsin NCBI

圖4 原料比對酶活力的影響Fig.4 Effect of raw material ratio on enzyme activity

2.3.2 培養時間

制曲的過程是微生物生長和產酶的過程，前期主要是米根霉的菌絲生長繁殖，產酶量較少，菌體的生長基本完成后就會迎來產酶高峰期，繼續培養孢子開始著生，反而會降低酶活力。由圖5可知，隨著培養時間的延長，糖化酶和液化酶的活力也隨之提高，在72 h達到最高水平，之后隨時間的增長曲的酶活力有所降低，故選取72 h為制曲的最佳時間。

圖5 培養時間對酶活力的影響Fig.5 Effect of incubation time on enzyme activity

2.3.3 料水比

在制曲過程中料水比是重要的指標，合適的料水比有利于米根霉的生長和酶的產出，較低的料水比會導致米根霉生長遲緩，不利的生長環境導致米根霉更容易生成孢子；較高的料水比會使原料表面生成水膜，導致氧氣的缺乏從而抑制米根霉的生長，由圖6可知原料質量40%的水為最佳條件。

圖6 料水比對酶活力的影響Fig.6 Effect of material-water ratio on enzyme activity

2.3.4 培養溫度

由圖7可知在30 ℃時液化酶活力最高，糖化酶活力隨溫度的升高而升高；由于較高的溫度會消耗更多的能量，并且高溫易使制曲過程中水分蒸發過快，導致米根霉生長環境惡化并產生大量孢子，同時也易生成大量雜菌，所以選擇30 ℃為最佳培養溫度。

圖7 溫度對酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on enzyme activity

2.3.5 接種量

從圖8可以看出，隨著接種量的提高，曲的酶活力也隨之提高。按照種曲質量與原料總質量的百分比進行接種。在接種量為3%時，糖化酶的活力最高；當接種量為3.5%，液化酶的活力最高；當接種量繼續提高時，由于菌體生長受到營養環境的制約，將更多的營養物質用于自身的生長，導致產酶量降低；因此綜合考慮選取3.5%為最佳接種量。

原青稞酒曲測定糖化酶活力為135.5 U/g，液化酶活力為25.6 U/g，優化過后的自制純種曲糖化酶活力達到1 246.9 U/g，液化酶活力達到61.4 U/g，比原曲酶活力分別提高了9.2、2.4倍。

圖8 接種量對酶活力的影響Fig.8 Effect of inoculum on enzyme activity

3 結果與討論

酒曲中的根霉屬和曲霉屬是起到糖化作用的微生物，結合實驗室分離培養的結果，米根霉是起到主要作用的菌種。在青稞酒的發酵過程中，米根霉首先生長繁殖并將青稞淀粉分解為酵母能夠利用的葡萄糖，同時產生的次級代謝產物是青稞酒的重要風味物質。發酵進行到中期時，酵母開始成為優勢菌，利用米根霉分解青稞淀粉產生的葡萄糖在完成自身的生長繁殖后生產酒精；其余非優勢菌種可能有生成青稞酒的特殊風味物質的作用。

實驗室培養法只分出4種微生物，證明酒曲中大部分微生物是很難在實驗室條件下培養出來的，而高通量測序法直接提取酒曲中的總DNA，然后采用通用引物進行PCR得到初始實驗數據，規避了實驗室分離純化這一步驟，在減少工作量的同時大大提高了酒曲中微生物的檢測范圍。在青稞酒試發酵的過程中，發現存在有主要發酵作用的優勢菌株，例如主要起到糖化液化作用的米根霉和產酒精作用的釀酒酵母，這些在發酵過程中數量有決定性優勢的菌株不但能在發酵過程中分離出來，并且可以輕易地在酒曲中分離出來。酒曲中復雜的微生物環境一方面給予青稞酒獨特的風味，另一方面可能存在生長受到優勢菌種抑制、對青稞酒的風味沒有貢獻的菌種。利用高通量測序與實驗室分離培養相結合的方法，可以篩選出在青稞酒發酵過程中起到主導作用的菌種，高通量測序可以較為全面地表現酒曲中微生物的多樣性，在確定優勢菌群的同時發現一些未知的微生物，豐富了微生物資源庫。

將主要的糖化菌株米根霉分離后制得的純種曲具有更高的糖化力和液化力，可以更加充分地利用青稞原料，從而減少生產成本；另一方面，利用單一菌種制曲和發酵更易控制生產流程，提高產品質量的穩定性。單菌種發酵可能導致酒的風味單一，解決這個問題是下一步研究的重點。

[1] 杜木英.西藏青稞酒發酵微生物及釀造技術研究[D].重慶：西南大學, 2008.

[2] 謝廣發.黃酒釀造技術[M].北京:中國輕工業出版社: 2010.

[3] 榮瑞金, 李祖明, 王德良, 等.中國酒曲微生物研究進展[J].中國釀造, 2009，28(6): 5-8.

[4] 趙東.西藏青稞酒酒曲微生物多樣性的研究[D].泰安：山東農業大學, 2011.

[5] 夏圍圍, 賈仲君.高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價[J].微生物學報, 2014，54(12): 1 489-1 499.

[6] IVEY M L, PHISTER T G.Detection and identification of microorganisms in wine: a review of molecular techniques[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2011, 38(10): 1 619-1 634.

[7] PORTILLO M D, MAS A.Analysis of microbial diversity and dynamics during wine fermentation of Grenache grape variety by high-throughput barcoding sequencing[J].Lwt-Food Science and Technology, 2016,72: 317-321.

[8] ERCOLINI D.High-throughput sequencing and metagenomics: moving forward in the culture-independent analysis of food microbial ecology[J].Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(10): 3 148-3 155.

[9] DAVID V, TERRAT S, HERZINE K, et al.High-throughput sequencing of amplicons for monitoring yeast biodiversity in must and during alcoholic fermentation[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2014, 41(5): 811-821.

[10] 陳亮亮.黃酒麥曲制曲工藝的優化研究[D].無錫：江南大學, 2013.

[11] 林偉民, 閆喆, 劉帆, 等.米曲霉PRB-1蛋白酶系和淀粉酶系與高鹽稀態醬油理化特性關系的研究[J].現代食品科技, 2015,31(11): 142-148.

[12] 伍怡酈.西藏傳統青稞酒發酵技術的研究[D].重慶：西南大學, 2006.

[13] 閆亮珍, 李曉然, 全哲學, 等.汾酒大曲和酒醅樣品DNA提取方法的優化[J].食品與發酵工業, 2011,37(3): 32-36.

[14] BOKULICH N A, JOSEPH C M L, ALLEN G, et al.Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine[J].Plos One, 2012, 7(5)：e36357.

[15] HAAS B J, GEVERS D, EARL A M, et al.Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons[J].Genome Research, 2011, 21(3): 494-504.

[16] MENDOZA L M, NEEF A, VIGNOLO G, et al.Yeast diversity during the fermentation of Andean chicha: A comparison of high-throughput sequencing and culture-dependent approaches[J].Food Microbiology, 2017(67): 1-10.

[17] 趙中開, 楊建剛, 馬瑩瑩, 等.純種米曲霉酒曲的制備工藝優化研究[J].中國釀造, 2014,33(7): 83-87.

[18] QB/T 4257—2011,釀酒大曲通用分析方法[S].北京: 中國輕工業出版社, 2011.