山葡萄酒主發酵降酸工藝篩選及優化

丁玉萍，高鵬飛，陳琦，韓誠武，李春豐，劉德江

(佳木斯大學 生命科學學院，應用微生物研究所，黑龍江 佳木斯，154007)

山葡萄與歐亞種釀酒葡萄差異較大，產于我國東北地區[1]，寒冷的地域特性造成山葡萄3大特點：一是糖度低，一般為130～150 g/L；二是酸度高，成熟果實的可滴定酸度含量在15～25 g/L(以酒石酸計)之間[2-3]，是釀酒葡萄酸度規定值的3～5倍，果汁pH值在2.90～2.95之間，尤其蘋果酸含量高[4]；三是營養成分高，其多酚、單寧、花青素、白藜蘆醇等物質含量均高于普通釀酒葡萄，這也是東北人喜歡用來釀酒的主要原因[5]。由于山葡萄蘋果酸含量較高，釀制的酒酸澀，降低酸度是生產干型山葡萄酒面臨的主要工藝難題。

目前，葡萄酒的降酸方法主要有3種:物理降酸、化學降酸和生物降酸[6-8]，其中應用較多的是生物降酸，即蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation, MLF)[9-10]。MLF是在主發酵結束后進行的二次發酵[11]，由于蘋果酸-乳酸發酵菌受到高酸度以及酒精的抑制作用，山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵難以啟動[12-13]，所以本研究嘗試將蘋果酸-乳酸發酵菌應用主發酵過程中，使酒精發酵與蘋果酸-乳酸發酵同時進行，旨在為降低山葡萄酒的酸度探究最佳工藝組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 山葡萄酒及菌株

山葡萄：佳木斯地區野生山葡萄(山葡萄汁pH 2.93±0.05，總酸度13.60±0.50，含糖量約為10.50±0.50)。

葡萄酒酵母(Y1)：安琪酵母股份有限公司；降酸酵母(Y2)：煙臺帝伯仕商貿有限公司；乳酸菌(Lactoenos 450 PreAC[L])：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.1.2 儀器與試劑

儀器：YXQ-LS-75SII高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊事業有限公司醫療設備廠；150G恒溫振蕩培養箱：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TDZ4-WS低速臺式離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；CJ-78-1A磁力加熱攪拌器：上海躍進醫療器械廠； PHS-3C型精密酸度計：杭州雷磁分析儀器公司。

試劑：酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、葡萄糖、硫酸鎂、蘋果酸鈉、檸檬酸三銨、碳酸鉀(食品級)、吐溫-80、蘋果酸、乳酸、正丁醇、冰乙酸、溴酚藍等，試劑均為分析純。

1.1.3 培養基

酵母培養基： 葡萄糖20 g/L，酵母浸液5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO41 g/L，CaCL20.3 g/L，溶于1 000 mL蒸餾水，于121 ℃滅菌20 min。

MRS培養基：葡萄糖10 g，牛肉蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，吐溫-80 1 mL，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，KH2PO42 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，121 ℃滅菌20 min。

1.1.4 紙層析液

展開劑：正丁醇∶冰乙酸∶蒸餾水為2∶1∶1。顯色劑：1 L展開劑中加入0.6 g溴酚藍。將試劑混合均勻后，倒入試劑瓶中，密封儲存備用[14-15]。

1.2 方法

1.2.1 干紅山葡萄酒釀制

工藝流程:

山葡萄→清洗挑選→破碎→加糖→接種→主發酵→過濾

技術要點：

山葡萄預處理：山葡萄清洗后，進行除梗分離，破碎，分裝在發酵瓶中。按葡萄重量10%的量加入蔗糖。

菌種活化：將保存的酵母菌、乳酸菌菌種分別接入酵母培養基和MRS培養基中，于25 ℃活化培養48 h后備用。

接種：按所需接種量取活化液體菌種，于2 800 r/min離心10 min，棄去上清液，將離心得到的沉淀用葡萄汁洗入發酵瓶中。

發酵：放置設定溫度的培養箱里發酵，每天測量失重，至恒重即主發酵結束。

過濾：用100目過濾袋進行自然過濾，得干紅山葡萄酒，于4 ℃恒溫儲藏備用。

1.2.2 山葡萄酒主發酵降酸最佳用菌組合篩選

將葡萄酒酵母(Y1)、降酸酵母(Y2)、乳酸菌(L)按表1進行組合，接入山葡萄汁中進行發酵，通過比較發酵后山葡萄酒的pH值，篩選出最佳用菌組合。

表1 山葡萄酒最佳菌種組合的篩選方案Table 1 V.amurensis wines of the best strains combinedscreening programme

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 溫度對山葡萄酒主發酵降酸的影響

將破碎分裝后的山葡萄按酵母菌和乳酸菌為6%和4%的量接入兩種菌種，分別置于室溫(20～22 ℃)、25、27、30℃四組溫度下進行發酵，探究溫度對山葡萄酒主發酵降酸的影響。

1.2.3.2 降酸酵母與乳酸菌比例對山葡萄酒主發酵降酸的影響

將降酸酵母菌(Y2)和乳酸菌(L)分別以5%+5%、6%+4%、4%+6%和3%+7%的接種量接入葡萄酒中，于25 ℃下進行發酵，探究降酸酵母菌與乳酸菌比例對山葡萄酒主發酵降酸的影響。

1.2.4 正交試驗

1.2.4.1 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對山葡萄酒主發酵溫度、混合菌(Y2∶L=1∶1)用量、發酵時間進行三因素三水平正交試驗L9(33)。正交試驗設計如表2所示。每組試驗做3個重復，結果取平均值。

表2 正交試驗設計表Table 2 Orthogonal test designs table

1.2.5 檢測方法

pH值的檢測采用精密酸度計測定；總糖的檢測采用3,5-二硝基水楊酸法測定；蘋果酸乳酸轉化量的檢測采用紙層析法測定。

2 結果與分析

2.1 山葡萄酒主發酵降酸最佳用菌組合篩選結果

測量接入不同菌種的山葡萄主發酵12～16 d酒液的pH值，結果如圖1所示。

圖1 不同菌種發酵山葡萄酒pH值的變化Fig.1 Different strains fermentation of V.amurensis wine pH value changes

從圖1可看出，接入不同菌種4個試驗組的pH值都有升高，隨著發酵時間的延長，pH值會略有下降。只添加葡萄酒酵母的山葡萄酒pH值的平均值為2.93，在為4組中最低；在發酵第13天時pH值達到最高值2.95，與發酵前的pH值相比增加了0.08。只添加降酸酵母的山葡萄酒pH值的平均值為3.06，發酵第12天和第13天均為最大值3.07，與發酵前的pH值相比增加了0.20。同時添加葡萄酒酵母和降酸酵母的山葡萄酒pH值的平均值為3.07，在發酵第13天時達到最大值3.09，與發酵前的pH值相比增加了 0.22。同時添加降酸酵母和乳酸菌的山葡萄酒pH值的平均值為3.12，為4組中最高；在發酵第13天時pH值達到最高值3.14，與發酵前的pH值相比增加了0.27，是4組中pH值升高最多高的一組。

比較各組最大pH升高值，(Y1+L)組(0.27)>(Y1+Y2)組(0.22)>Y2組(0.20)>Y1組(0.08)，即添加降酸酵母和乳酸菌組合降酸效果最好，其次為添加葡萄酒酵母和降酸酵母組合、添加單一降酸酵母組，添加單一葡萄酒酵母組降酸效果最差。

測量接入不同菌種的山葡萄主發酵12 d酒液的總糖，結果如表 3所示。

表3 不同菌種發酵的山葡萄酒總糖含量Table 3 Total sugar content of different strainsfermentation of V.amurensis wine

總糖含量小于 4 g/L為干紅葡萄酒，從表3可看出，4種不同菌種發酵的山葡萄酒總糖含量均小于4 g/L，說明發酵12 d，發酵基本結束，為干紅葡萄酒。

2.2 單因素試驗

2.2.1 溫度對山葡萄酒主發酵降酸的影響

測量山葡萄在不同溫度下發酵13～17 d的pH值，結果如圖2所示。

圖2 溫度對山葡萄酒主發酵降酸的影響Fig.2 Effect of temperature on V.amurensis wine main fermentation and deacidificatio

從圖2可看出，不同溫度下發酵的山葡萄酒的pH值都有升高，隨著發酵時間的延長，pH值會略有下降。室溫(20～22 ℃)下發酵的山葡萄酒平均pH值為 3.158，為4組中最低，在發酵第14 d時pH值達到最高值3.18，最大值與發酵前的pH值相比增加了0.23， pH升高值為4組中最??； 25 ℃下發酵的山葡萄酒平均pH值為3.202，為4組中最高，在發酵第14天時pH值達到最高值3.22，最大值與發酵前的pH值相比增加了0.27，pH升高值為4組中最大； 27 ℃下發酵的山葡萄酒平均pH值為3.184，發酵第14天時pH值達到最大值3.20，最大值與發酵前的pH值相比增加了0.25；30 ℃下發酵的山葡萄酒平均pH值為3.180，在發酵第14天時達到最大值3.20，最大值與發酵前的pH值相比也增加了0.25。

比較各組最大pH升高值為25 ℃(0.27)>27 ℃(0.25)=30 ℃(0.25)>室溫(0.23)。即降酸效果最好的發酵溫度，25 ℃，其次為27 ℃、30 ℃，降酸效果最差的為室溫(20～22 ℃)。由此可見，主發酵溫度為25 ℃時有利于山葡萄酒的降酸。

2.2.2 降酸酵母與乳酸菌比例對山葡萄酒主發酵降酸的影響

測接種不同比例的降酸酵母與乳酸菌的山葡萄發酵13～17 d的pH值，結果如圖3所示。

圖3 酵母菌與乳酸菌比例對山葡萄酒主發酵降酸的影響Fig.3 The proportion of lactic acid bacteria and yeast effects on main fermentation of V.amurensis wine and deacidification

從圖3可看出，4組設置不同酵母菌與乳酸菌比例的山葡萄酒的 pH 值整體都有升高，隨著發酵時間的延長，pH 值會略有下降。

接種酵母菌和乳酸為(6%+4%)的山葡萄酒平均pH值是3.186，為4組中最高，在發酵第13天時pH值達到最高值3.20，最大值與發酵前的pH值相比增加了0.25，為4組中最大；接種酵母菌和乳酸為(5%+5%)的山葡萄酒平均pH值為3.170，在發酵第13、14、15天時pH 值均為檢測5 d中的最高值3.18，最大值與發酵前的pH值相比增加了0.23；接種酵母菌和乳酸為(4%+6%)的山葡萄酒平均pH值為3.166，發酵第14、16天時pH值均為檢測5 d中的最大值3.18，最大值與發酵前的pH值相比增加了0.23；接種酵母菌和乳酸為(3%+7%)的山葡萄酒平均pH值為3.162，在發酵第13天時達到最大值3.18，最大值與發酵前的pH值相比增加了0.23。

比較酵母菌與乳酸菌接種比例不同的各組平均pH值，(6%+4%)組(3.186)>(5%+5%)組(3.170)=(4%+6%)組( 3.166)=(3%+7%)組(3.162)。由此看出，降酸效果最好的組為酵母菌與乳酸菌為(6%+4%)的山葡萄酒，其次為(5%+5%)、(4%+6%)，降酸效果最差的為(3%+7%)的山葡萄酒。所以，酵母菌與乳酸菌為(6%+4%)的配比組合更有利于山葡萄酒主發酵的降酸。

2.3 正交試驗

表3 L9(33)正交試驗結果與數據分析Table 3 L9(33)The results of orthogonal experimentand data analysis

通過對表3進行分析，比較極差R可得，RB>RA>RC，3個因素對山葡萄酒主發酵降酸的影響為：菌種接種量對山葡萄酒降酸影響最大，其次為發酵溫度，發酵時間對試驗結果影響最??；A因素列：K1>K2>K3，B因素列：K3>K1>K2，C因素列：K1>K2>K3，因此，正交試驗結果的最優組合為A1B3C1，即發酵溫度22 ℃，菌種接種量為12%，發酵時間13 d。

直接觀察表3可知，6組(A2B3C1)的pH值3.19，是9個試驗組中最高的。分別按6組(A2B3C1)和分析得到的最優組合Y組(A1B3C1)的條件發酵山葡萄酒，對2份酒樣以及單一葡萄酒酵母發酵的山葡萄酒樣(Y1J)進行紙層析對比試驗，觀察蘋果酸、乳酸轉化進程，結果如圖4所示。

由圖4可知，Y組和6組均有乳酸斑點出現，葡萄酒酵母發酵的山葡萄酒酒樣(Y1J)無乳酸斑點出現，說明Y組和6組酒樣已有蘋果酸轉化為乳酸，而葡萄酒酵母發酵的山葡萄酒酒樣的沒有蘋果酸轉化為乳酸，此酒樣pH值為2.89，pH升高值很小，與紙層析結果相吻合。6組比Y組比較，6組蘋果酸的斑點明顯，說明6組的蘋果酸轉化比Y組的多，6組工藝為最優組合，即發酵溫度25℃，菌種接種量為12%，發酵時間13d。

圖4 驗證試驗酒樣的蘋果酸-乳酸轉化進程Fig.4 Malolactic fermentation process on replication experiment wine samples

3 結論與討論

通過對山葡萄酒主發酵降酸最佳用菌的篩選和主發酵降酸最佳工藝條件的優化試驗可知，如果將降酸酵母菌和蘋果酸-乳酸發酵菌同時接入山葡萄汁進行主發酵，在完成酒精發酵的同時，可以部分地將蘋果酸轉化為乳酸，降低山葡萄酒的酸度，而不影響酒的發酵速度和風味。山葡萄酒主發酵降酸最佳菌種組合為降酸酵母菌與乳酸菌組合，降酸酵母菌與乳酸菌最佳比例為3∶2，最佳總接種量為12%，最佳發酵溫度為25 ℃，最佳發酵時間為13 d。在此條件下進行干紅山葡萄酒發酵，可使葡萄酒pH值升高0.25～0.30，山葡萄原酒的酸澀味會有一定程度的減弱，適口性提高。

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