南海刺參皂苷的分離純化及其抑瘤活性研究

張蕊 孫宏偉 徐成

南海刺參皂苷的分離純化，分析和評價南海刺參皂苷的對腫瘤的抑制效果，為利用海參皂苷研制高效抗腫瘤藥物創(chuàng)造條件。方法：先后利用大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析和HPLC對南海海參皂苷進(jìn)行了純化，并利用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的方法對純化組分的抗腫瘤活性進(jìn)行了測定。結(jié)果：海參皂苷對小鼠肉瘤細(xì)胞系S180、人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco- 2和人宮頸癌細(xì)胞系Hela的均有明顯的生長抑制作用。結(jié)論：本研究為南海海參皂苷在預(yù)防和治療腫瘤中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，同時也為南海海參中生物活性物質(zhì)利用提供了新的思路。

海參具有較高的營養(yǎng)價值和膳食補(bǔ)充。在海參的壁和內(nèi)臟中，可分泌一些活性物質(zhì)，即海參皂苷。海參皂苷是海參的主要次生代謝產(chǎn)物，是化學(xué)防御的物質(zhì)基礎(chǔ)。具有抗腫瘤、抗真菌、抑制細(xì)胞生長、免疫調(diào)節(jié)和溶血等多種生理和藥理活性。海參皂苷的分離純化及其藥物研究已引起人們的廣泛關(guān)注。采用大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析和半制備型HPLC對刺參皂苷進(jìn)行分離純化，并對純化組分的抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。

材料與方法

材料。南海海參市售，由中國青島海洋大學(xué)對樣品進(jìn)行種屬鑒定。癌細(xì)胞是由北京維通利華動物有限公司提供的小鼠肉瘤S180細(xì)胞株、人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco- 2和人宮頸癌細(xì)胞系Hela。

實(shí)驗(yàn)方法

（1）南海海參總皂苷的制備

10kg粉碎de 新鮮南海海參，用60%乙醇冷浸5次，每次3天，減壓回收乙醇提取物得清膏。將流浸膏均勻分散于水中，裝入預(yù)處理后的HP - 20大孔樹脂柱中，分別用水、80 %乙醇溶液和95 %乙醇溶液洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓回收得到粗總皂苷。 粗總皂苷通過氯仿∶甲醇∶水梯度洗脫的正相硅膠柱層析進(jìn)一步純化， 溶液的梯度為10∶1∶0.1到7 ：3 ：0.3。用硅膠板薄層色譜法檢測洗脫組分后，再用半制備型HPLC對流動度相同的洗脫組分進(jìn)行合并純化。色譜柱為：A A 12S0 5- 2510W T O D S C 8，流動相為甲醇：水，流速為1.5毫升，最小檢測波長為205nm。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)

S180和Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，Caco- 2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，其中均含2%的青/鏈霉素。細(xì)胞置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（3）腫瘤細(xì)胞活力測定

收集對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，按照S180（5×04/mL）、Caco-2（2.5×104/mL）和Hela（2×104/mL）調(diào)整細(xì)胞密度，96孔板每個孔100μL/，對照組用水培養(yǎng)，每組3個重復(fù)，培養(yǎng)時間為48、72h。采用MTT法測定吸光度OD570值。細(xì)胞存活率（%）=（樣品組OD570/正常對照組D570）×100。

統(tǒng)計學(xué)方法。統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用R3.4.1軟件t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，以p<0.05為差異有顯著性。

結(jié)果

采用質(zhì)譜法測定了南海海參5.47%的皂苷含量。高子陽研究了11種市售海參和8批干海參中總皂苷的含量。結(jié)果表明，海參總皂苷含量在3.16 %～5.27%之間，結(jié)果顯示南海海參總皂苷含量明顯高于其他種類的海參。南海海參皂苷對3種腫瘤細(xì)胞活力的影響見表1所示。經(jīng)4μg/mL以上的海參皂苷處理后，三種癌細(xì)胞的生長均受到顯著的抑制，抑制作用與處理時間成正比。其中，在樣品作用72h后，海參皂苷對三種癌細(xì)胞細(xì)胞存活率的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為7.17、9.78和8.03μg/mL，是一種優(yōu)良的海參皂苷來源物種。

結(jié)果表明，南海海參皂苷含量豐富，體外增殖抑制活性顯著高于其他海參，可作為海參皂苷的良好生物來源。海參皂苷在南海的抗腫瘤作用可能與提高機(jī)體免疫力和抗氧化水平有關(guān)。本研究為海參皂苷在腫瘤防治中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，也為低值海參生物活性物質(zhì)的高價值利用提供了新的思路。海參的抗腫瘤作用的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。