2016—2017年度駐南蘇丹維和二級醫院對特定人群瘧原蟲常規檢查方法的完善和改進

苗 杰，劉文斗，潘希貴，史 功，王 鑫

瘧疾是由血源性病原體瘧原蟲經按蚊叮咬傳播的乙類傳染病，臨床上輸注了含有瘧原蟲裂殖體或裂殖子的血液亦可引起瘧疾。加強對瘧疾病原體的篩查力度，可有效防控血液制品中瘧原蟲的混入和輸血造成的傳染。目前，瘧疾實驗室鑒定方法主要有快速檢測試劑條（RDT）、鏡檢和聚合酶鏈式反應（PCR）三種，但缺乏標準流程和統一標準。非洲是瘧疾高發區，筆者所在非洲維和任務區二級醫院野戰條件下開展瘧原蟲的實驗室常規檢查，積累了一定做法和經驗，該文就此進行了梳理和總結。

1 資料與方法

1.1 主要設備及試劑 邁瑞血細胞分析儀 （BC－3000），Olympus光學顯微鏡（KX－21），瑞氏－姬姆薩染液，萬孚（Wondfo）瘧原蟲膠體金檢測條。

1.2 方法 收集2016年9月—2017年8月維和二級醫院共收到瘧原蟲實驗申請（不含健康體檢）348人/次，抗凝血標本348份，制作厚薄血涂片348張，共篩查出瘧原蟲陽性病例74例，其中惡性瘧陽性57例，非惡性瘧陽性6例，混合瘧陽性11例，陽性檢出率為21.26%；膠體金檢測法對間日瘧和惡性瘧特異度高，覆蓋全部陽性病例，鏡檢法參比膠體金法的檢測符合度為85.42%。

2 結果

2.1 瘧原蟲形態學觀察 鏡檢陽性標本中，紅細胞內間日與惡性瘧原蟲類型多見，卵形和三日瘧典型特征少見，這也跟文獻報道一致［1，2］；以環狀體、大滋養體居多（如圖1、2箭頭所示），偶見配子體和裂殖體。瑞－姬染色后，蟲體核為紅色，胞質為藍色；間日瘧原蟲環狀體（小滋養體）鏡下觀察呈戒指狀，環較大，核1個，見圖1；其大滋養體蟲體大，形狀不規則，空泡明顯，瘧色素為棕黃色，同時被寄生的紅細胞可見體積脹大，顏色變淺，并伴有散點，見圖1。惡性瘧環狀體纖細，環較小，核1～2個，紅細胞內常有兩個以上原蟲，如圖2。

圖1 間日瘧原蟲環狀體（R）、大滋養體（T）（oil，100×）

圖2 惡性瘧原蟲環狀體（R）（oil，100×）

2.2 瘧原蟲實驗室檢驗報告結果 陰性標準：膠體金法無紅色反應線，鏡檢整張厚血膜時間不低于20 min，觀察不低于100個視野未發現瘧原蟲蟲體，可報告陰性。陽性標準：膠體金法現紅色反應線，鏡檢發現瘧原蟲蟲體，可報告陽性，參考因素有詢問患者有典型“打擺”癥狀，NEUT%（中性粒細胞百分率）指標偏高等。分型：因間日瘧與惡性瘧治療用藥不同，實驗室應盡可能報告查明的蟲體類型，以有助于臨床針對性用藥。考慮到間日瘧、三日瘧和卵形瘧鏡下蟲體形態較難判斷，且三日和卵形瘧極少，因此將蟲體分型呈三種報告格式，即：惡性瘧、非惡性瘧和混合瘧；原蟲數量：因瘧疾治療用藥劑量不同，實驗室應盡可能報告查明的蟲體數量，以鏡檢每視野發現的瘧原蟲平均數量來區別開 “大量”和“少量”，同時輔以參考膠體金檢測線較質控線的明顯程度。兩種檢驗方法不符時的處理：如遇膠體金顯示為陽性，但鏡檢未發現蟲體，應考慮蟲體密度低和鏡檢因素影響造成鏡下難以發現或辨別的情況，此時依從膠體金法報告陽性。并結合臨床，對于原蟲初染患者提示醫師及時給藥，對于復發或再燃患者應提示調整用藥并定期復查。

3 討論

寄生人體的瘧原蟲有4種，即間日瘧原蟲（Plasmodium vivax，P.v）、惡性瘧原蟲（P.falciparum，P.f）、三日瘧原蟲（P.malariae，P.m）和卵形瘧原蟲（P.ovale，P.o）。瘧原蟲的鑒定主要運用了病原學、免疫學和分子生物學三種原理［3，4］，現階段基層檢驗科和野戰條件下瘧原蟲檢驗使用鏡檢法和膠體金法，其中鏡檢法最低檢出限為3～4個/萬紅細胞，膠體金快速法最低檢出限為10～20個/μl血 （約350萬～600萬紅細胞），膠體金法靈敏度明顯高于鏡檢法，因此有研究提出膠體金法可取代鏡檢法作為基層實驗室檢驗瘧原蟲的唯一方法［5－7］。

因瘧疾的治療主要應用抗瘧藥，且不同類型的瘧疾用藥不同，比如間日瘧的治療以氯喹和伯氨喹聯合應用為首選，惡性瘧為蒿甲醚或硫酸奎寧，抗瘧疾復發藥物為伯氨喹。因此，筆者認為實驗室報告應盡可能地涵蓋瘧原蟲蟲種（性）和數量（量）信息。通過回顧來看，對于血液瘧原蟲密度低的原蟲感染者，單純用鏡檢法很難檢出［8］，膠體金法可加以補充；并且，兩種方法聯用可實現瘧原蟲的“定性”和“定量”，即：“定性”以膠體金法為主，鏡檢法為輔；“定量”以鏡檢法為主，膠體金法為輔。分析誤差原因，鏡檢法由于結果受血涂片質量、檢驗人員經驗水平、視覺疲勞度、瑞－姬染色效果、燃料沖洗不凈、血小板黏附紅細胞以及對瘧原蟲形態的分辨能力等諸多因素影響［9，10］，從而易造成假陰性和假陽性；膠體金法影響因素包括：觀察超時，或反應液配比失衡、加血過量本底深，此外還可能存在交叉反應等。因此，瘧原蟲的實驗室檢驗中最好鏡檢和膠體金兩種方法聯合運用，可相互彌補。

瘧疾臨床癥狀有典型的周期性寒戰、發熱、出汗及貧血和脾大，臨床醫師可據此初步診斷以決定是否向實驗室提交瘧原蟲檢查申請，但癥狀不典型或缺如時可能造成臨床漏診和實驗室漏檢。有文獻報道，瘧疾患者血常規參數及部分生化指標會發生較顯著改變，其中涉及到瘧疾患者血液中RBC、HGB及PLT明顯降低，對惡性瘧患者血液中PLT及TCH指標變化顯著［11］等，但也有報道指出瘧疾患者的RBC和HGB水平降低并無顯著意義［12］。分析以上原因，很可能系樣本量不足及血液的人種、年齡差異所致，但同時也提示這些指標具有一定的輔助診斷價值。因此，在目前瘧疾與血液指標相關性尚不清楚的情況下，建議臨床醫師應注意參考患者血常規中WBC、RBC、HGB、PLT指標，可加開肝功生化檢查，留意血清中ALT、AST、TCH的變化，必要時補檢瘧原蟲，以最大程度的減少漏診和漏檢情況的發生。

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