特異腐質霉角質酶在大腸桿菌中的表達和發酵優化

孫益榮吳 敬宿玲恰

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學教育部食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫 214122)

角質酶是一種多功能水解酶，可用于水解短鏈或長鏈脂肪酸酯類和甘油三酯，也可用于降解植物的多聚體角質[1-2]。相較于普通的脂肪酶，角質酶缺少了蓋子結構，更易于降解聚酯。基于以上功能特點，角質酶在食品加工和紡織工業等方面具有廣泛的應用前景[3-6]，尤其在棉織物的生物精煉和人造纖維的表面改性中，角質酶有望替代傳統的化學堿處理，對環境保護有重要意義。

目前角質酶的主要來源包括微生物和花粉2種，其中微生物來源又可細分為致病真菌、部分細菌和少數放線菌三部分[7]。國內外的研究早期集中在植物病原真菌Fusariumsolanipisi[8]、Pyrenopezizabrassicae[9]來源的角質酶上，后續又篩選得到放線菌Thermobifidafusca[1]、Streptomycesacidiscabies[3]和細菌Pseudomonasputida[10]等產角質酶菌株。絕大多數角質酶，諸如ThermobifidaFusca角質酶，適用溫度范圍為30～60 ℃。而特異腐質霉(Humicolainsolens，H.insolens)角質酶最適溫度為80 ℃，并有良好的耐熱性。在此應用溫度下，棉纖維表層的蠟質會因高溫融化，有利于角質酶與角質的結合，提升酶應用效能。因此，特異腐質霉來源的角質酶具有更好的應用前景。為了更好地生產角質酶，構建工程菌生產重組蛋白是目前研究的主要方式。因而選擇合適的表達宿主顯得尤為重要。大腸桿菌表達系統作為目前研究最深入、開發最成熟的一種表達系統，具有培養周期短、表達效率高、遺傳相對穩定、操作相對簡便的特點[11]，是生產異源蛋白最常用的系統之一。

本試驗擬將Humicolainsolens來源的角質酶基因在大腸桿菌中進行克隆表達，測定其酶學性質，并在3 L發酵罐的水平上進行擴大培養及條件優化，為H.insolens角質酶在工業中的應用及后續的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質粒

H.insolens角質酶基因、克隆宿主E.coliJM109、表達宿主E.coliBL21(DE3)、表達載體pET 20b(+)：作者所在實驗室保藏；

克隆載體pMD18-T simple vector：寶生物工程(大連)有限公司；

PCR引物：生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2 主要試劑

DNA Marker、瓊脂糖、T4DNA連接酶、限制性內切酶NcoI和Hind III、堿性磷酸酶(CIAP)及PCR聚合酶PrimeSTAR：寶生物(大連)工程有限公司；

氨芐青霉素(Amp)：分析純，生工生物(上海)工程有限公司；

異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)：分析純，阿拉丁生化(上海)科技有限公司；

普通DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒：天根生化(上海)科技有限公司；

分子級胰蛋白胨和酵母粉：英國Oxoid公司；

蛋白分子量標準品、蛋白質凝膠電泳試劑盒：碧云天(上海)生物科技有限公司；

其它試劑：分析純，國藥集團(上海)化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基：胰蛋白胨 10.0 g/L、酵母粉 5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；

TB培養基：甘油 5.0 g/L、胰蛋白胨 12.0 g/L、酵母粉 24.0 g/L、K2HPO4·3H2O 16.43 g/L、KH2PO42.35 g/L；

3 L罐發酵培養基：工業級蛋白胨 1.2 g/L、工業級酵母粉 2.4 g/L、甘油 8.0 g/L、KH2PO413.5 g/L、(NH4)2HPO44.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、檸檬酸 1.7 g/L、微量元素液10 mL，用氨水(氫氧化銨)調pH 7.0；

3 L罐補料培養基：工業級蛋白胨 2.4 g/L、工業級酵母粉 4.8 g/L、MgSO4·7H2O 18.35 g/L、甘油600.0 g/L；

微量元素液：Al2(SO4)3·18H2O 2.0 g/L、CoSO4·7H2O 0.75 g/L、H3BO30.5 g/L、MnSO4·7H2O 24.0 g/L、Na2MoO43.0 g/L、NiSO4·6H2O 3.0 g/L、ZnSO4·7H2O 1.0 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌表達質粒的構建 設計帶有酶切位點NcoI 和Hind III的引物，使用PCR儀擴增特異腐質霉角質酶對pET20b(+)載體使用NcoI、Hind III雙酶切，CIAP處理防止載體自連，膠回收后獲得線性化的載體。在T4 ligase體系下將基因同載體連接過夜，轉化JM109感受態細胞，經氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性轉化子。對獲得的轉化子提質粒，經NcoI、Hind III雙酶切驗證正確，即質粒pET20b(+)/HIC。質粒由生工生物工程(上海)有限公司測序。將驗證正確的質粒pET20b(+)/HIC轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，經氨芐青霉素抗性平板篩選和LB/AMP培養基培養后，使用濃度為15%的甘油管保藏菌種，于-80 ℃冷凍保藏。

1.2.2 重組菌誘導表達 取保藏的特異腐質霉角質酶重組菌接種于LB/AMP培養基中，37 ℃、150 r/min震蕩培養8 h后，轉接至TB培養基中，接種體積分數5%；37 ℃、150 r/min培養至OD600約為1.5時，加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG，于25 ℃、150 r/min條件下培養24 h左右，直至發酵液中的角質酶酶活不再增高。

1.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳檢測 洗凈并組裝制膠裝置，用水檢漏，確保裝置不漏水。依據試劑盒配方配置分離膠，混勻后加入到裝置內，用水液封。于37 ℃烘箱靜置30 min，待分離膠凝固后用濾紙除去裝置中殘留的水。配置濃縮膠，加入到槽內，插入梳子，室溫下等待濃縮膠凝固。取1 mL發酵液12 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL和5 μL的上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，上樣8 μL。設置電泳儀電壓300 V，電流60 mA，運行20 min左右，當藍色條帶到達凝膠底部時停止。輕輕地將凝膠與制膠板分開，剝下的膠用考馬斯亮藍染液染色45 min左右。按照水、乙醇、冰乙酸16∶1∶3的比例配置脫色液，用于蛋白膠脫色，約12～20 h可脫色完全。

1.2.4 酶活力測定方法ρNPB水解酶活性：在37 ℃下，使用連續分光光度法測定酶活力。反應總體積為1.5 mL，包括30 μL 50 mmol/L對硝基苯丁酸酯(ρNPB)的底物，30 μL酶液，和1 440 μL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)。在405 nm波長下，記錄對硝基酚的增長速率，反應時間1 min。酶活定義：37 ℃下，每分鐘將對硝基苯丁酸酯(ρNPB)催化水解生成1 μmol 對硝基酚的酶量，即為一個酶活力單位(U)。

1.2.5 重組菌最適溫度及最適pH測定

(1) 最適溫度：分別在不同溫度條件下測定同等量的角質酶活力，最高酶活力定義為100%，計算不同溫度條件下的相對酶活，探究最適溫度。

(2) 最適pH：在不同pH條件下(pH 5.0～10.0)測定等量酶液的酶活，定義最高酶活為100%，計算不同條件下角質酶的相對酶活，探究最適pH。

(3) 緩沖體系為：Na2HPO4-NaH2PO4緩沖體系(5.0～7.0) 、Tris-HCl緩沖體系(pH 7.0～9.0)和Gly-NaOH緩沖體系(pH 9.0～10.0)。

1.2.6 重組菌溫度穩定性及pH穩定性測定

(1) 溫度穩定性：取同等量的酶液，分別置于60，80 ℃ 的水浴鍋中保溫處理，60 ℃樣品間隔120 min取樣一次，80 ℃ 樣品間隔5 min取樣一次，測定樣品酶活力。定義0 h樣品的酶活為最高酶活100%，計算角質酶殘留酶活在不同溫度下隨時間的變化情況，探究該酶的溫度穩定性。

(2) pH穩定性：取不同pH值(pH 5.0～10.0)條件下的酶液，于室溫靜置48 h，取等量酶液測定酶活，最高酶活定義為100%，計算不同pH條件下的角質酶殘留酶活變化情況，探究角質酶的pH穩定性。緩沖體系同1.2.5(3)。

1.2.7 3 L發酵罐擴大培養 將保藏的甘油管，以2%的接種體積分數轉接至50 mL工業級LB培養基中，并添加終濃度為0.1 g/L的氨芐青霉素，37 ℃、200 r/min培養8 h。取上述種子以10%的接種體積分數，轉接至3 L NBS BioFlo-115型發酵罐中，起始裝液量為1 L(包括900 mL的3 L罐發酵培養基和100 mL種子)。維持生長溫度37 ℃、溶氧30%，通過補加氨水的方式維持pH 7.0。培養5～7 h后，上罐培養基中的碳源耗盡，溶氧反彈。此后以指數流加的方式向發酵罐中加入補料培養基至發酵結束，比生長速率控制在μ=0.18 h-1。補料階段6～8 h，在菌體生長至特定OD后進入乳糖誘導階段，恒速流加0.2 g/(L·h)的乳糖溶液，誘導時間、誘導溫度由對應的發酵策略決定。誘導后，間隔一定時間取樣，測定樣品的菌濃(OD600)和酶活，當酶活出現顯著下降趨勢后結束發酵。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒的構建

設計帶有酶切位點NcoI 和Hind III的引物，使用PCR儀克隆并擴增目的基因HIC。同pET20b(+)載體連接后，轉入JM109感受態細胞，經氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性轉化子。對獲得的轉化子提質粒，NcoI、Hind III雙酶切驗證，結果見圖1。從圖1可知，600 bp處出現目的條帶，與H.insolens角質酶基因的理論大小相符，重組質粒pET20b(+)/HIC構建完成。

2.2 重組角質酶在大腸桿菌中的表達

將構建完成的重組質粒 pET20b(+)/HIC轉入BL21(DE3)感受態細胞，經氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性轉化子。將轉化子轉接至搖瓶中，依據1.2.2所述方法進行誘導表達，24 h酶活達到最大值，此后保持穩定，據此結束發酵。發酵液中的胞外酶活為170 U/mL、胞內酶活<1 U/mL，總酶活170 U/mL。發酵上清液的蛋白電泳圖見圖2。從圖2可知，20 kDa處有明顯的條帶，與HIC的理論相對分子質量一致，表明H.insolens來源的角質酶基因HIC已在大腸桿菌中正確表達。

M. DNA Marker 1. 質粒pET20b(+)/HIC經NcoI/HindIII雙酶切后的條帶

圖1 重組質粒pET20b(+)/HICNcoI、Hind III雙酶切電泳圖

Figure 1 Restriction enzyme digestion analysis of pET20b(+)/HIC

M. 蛋白質分子量標準(高) 1.H.insolens角質酶重組菌發酵培養基上清液組分

圖2 重組菌搖瓶發酵胞外上清液SDS-PAGE分析

Figure 2 SDS-PAGE analysis of culture supernatant of recombinant strains

2.3 重組角質酶的酶學性質

2.3.1 最適pH和pH穩定性 從圖3(a)可知，伴隨pH值的改變，重組角質酶酶活出現明顯變化，pH處于5.0～8.5時，相對酶活逐漸上升；pH處于8.5～10.0時，相對酶活逐漸降低；說明重組酶最適pH值為8.5。從圖3(b)可知，pH 5.0～10.0時，放置48 h酶活幾乎無變化。

2.3.2 最適溫度和溫度穩定性 從圖4(a)可知，30～80 ℃時，相對酶活呈逐漸上升趨勢；80～85 ℃時，相對酶活逐漸下降，說明重組酶的最適反應溫度為80 ℃。從圖4(b)、(c)可知，重組角質酶80 ℃條件下的溫度半衰期為11 min，60 ℃ 條件下溫度半衰期為14 h。

2.4 重組角質酶在3 L發酵罐中的發酵優化

2.4.1 誘導時間對高密度發酵的影響 重組菌于3 L罐發酵過程中，誘導時間會顯著地影響到菌體濃度和異源蛋白的表達量。誘導時間過早，會對宿主菌的生長造成負擔，降低細胞生長速率，影響到異源蛋白的正常表達。誘導時間過晚，會導致誘導強度不足，最終影響到蛋白表達量[12]。為探求最佳的誘導時間，獲得最高的重組角質酶蛋白表達量，本研究中統一控制發酵罐誘導溫度為30 ℃、乳糖濃度為0.2 g/(L·h)，分別在菌濃OD600為30，40，50，65時開始恒速流加乳糖溶液，測定各誘導階段的菌體生長情況和蛋白表達情況，結果見圖5。

圖3 重組角質酶的最適pH和pH穩定性

圖4 重組角質酶的最適溫度和溫度穩定性

圖5 誘導時間對重組菌生長和產酶的影響

從圖5可知，當菌體濃度OD600為30時開始乳糖誘導，菌體生長和蛋白表達受到顯著影響，最終導致重組菌于OD600為82時即停止生長，其最高酶活僅為1 766 U/mL；當菌體濃度OD600為40時開始乳糖誘導，菌體最終生物量(OD600)和蛋白表達情況亦受到一定影響，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活為2 150 U/mL；當菌體濃度OD600為50時開始乳糖誘導，菌體生長狀況良好，蛋白正常表達，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活為2 233 U/mL；當菌體濃度OD600為65時開始乳糖誘導，OD600為100后菌體生物量達到最高，此后逐漸下降，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC的最高酶活為1 934 U/mL。OD600為50時誘導的菌體生長及蛋白表達情況均優于OD600為30，40，65時誘導的，故本研究認為OD600為50時進行誘導為最佳誘導時間。

2.4.2 誘導溫度對高密度發酵的影響 誘導溫度是影響菌體生長和重組蛋白產量的因素之一。溫度較低時菌體生長速率降低，菌體濃度低，進而影響重組蛋白的表達；溫度過高，細胞內多肽鏈合成速度加快，當合成速率大于折疊速率后，會造成多肽鏈聚集而無法正確折疊，最終以不溶性包涵體的形式沉積。故選擇最合適的誘導溫度，對提高重組菌株在3 L發酵罐中的產酶量有重要意義。

依據2.4.1的試驗結果，當菌體濃度OD600達到50后進入誘導階段，此時分別選擇3種不同的溫度(25，30，35 ℃)，統一恒速流加[0.2 g/(L·h)]乳糖溶液進行誘導，以測定不同誘導溫度對重組蛋白表達的影響，結果見圖6。從圖6可知，當誘導溫度為25 ℃時，菌體生長緩慢，菌體生物量OD600為84時即停止生長，蛋白表達亦受到抑制，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活為1 565 U/mL，為3種溫度下的最低值。當誘導溫度為30 ℃時，菌體生物量OD600最高為104，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活為2 233 U/mL。當誘導溫度為35 ℃時，菌體生長情況最好，菌體生物量OD600最高達到114，但是重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-HIC最高酶活僅為1 772 U/mL，明顯低于30 ℃時的，其原因可能是過高的溫度和過快的菌體生長速度，導致蛋白不正常折疊形成大量沒有活性的包涵體，故認為30 ℃為最佳誘導溫度。

圖6 誘導溫度對重組菌生長和產酶的影響

3 結論

角質酶可有效降解棉纖維表層角質，增強纖維潤濕性，在紡織工業中有很好的應用前景。但是，工業中處理棉纖維的常用方法，均需在高溫環境下進行才能保證處理效果。而目前已報到的角質酶基因來源，催化溫度偏低，在實際使用時需多次改變溫度、工藝復雜，工業化應用受到了明顯的限制。本試驗為解決上述問題，嘗試在E.coli中重組表達了H.insolens來源的角質酶基因，重組后的角質酶最適溫度高達80 ℃，在高溫應用環境下可保持一段時間的穩定。進一步將重組酶在3 L罐中進行發酵優化，確定了重組酶的最佳誘導溫度為30 ℃，菌體濃度OD600為50時進行誘導為最佳誘導時間，獲得的最高酶活可達2 233 U/mL。本研究可為角質酶在棉織物精練工業中的應用提供新的研究思路，而且簡化工藝流程、降低生產成本。

但由于本試驗在3 L罐中的發酵罐數較少，存在優化不徹底的問題，重組酶的表達仍處于較低水平。因此，在后續研究中，應圍繞誘導強度和重組蛋白表達量之間的關系進一步優化發酵工藝。其次，在優化過程中，還應考慮到該角質酶具有磷脂水解活性的特點，在重組菌發酵過程中可能會對宿主細胞膜造成損傷，因而發酵過程中平衡誘導強度、菌體濃度及蛋白表達量之間的關系也是十分關鍵的。如果能很好地解決上述問題，獲得更好的蛋白表達及更短的發酵周期，將會對降低角質酶生產成本有重要的意義。

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