白樺脂酸與紅棗總三萜酸對小鼠酒精肝損傷的保護作用

蔡天嬌，王瑞珍，魏君慧，薛 媛，雷宏杰*，徐懷德*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

紅棗為鼠李科棗屬植物的成熟果實，我國棗樹種植面積已接近300萬 hm2，原棗年產量超過800萬 t，占世界棗樹種植面積和產量的98%以上。紅棗是一種藥食同源的食品，傳統中醫藥認為紅棗具有保肝護肝、補血益氣、養胃健脾等功能[1]。紅棗不僅含有豐富的糖類、礦物質元素、VC等營養成分[2]，還含有多酚、黃酮、環磷酸腺苷以及三萜等多種生物活性成分[3-4]。紅棗三萜類化合物中熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸（betulinic acid，BA）等較為典型[5]，相關研究多集中在提取[6]與含量分析[7-8]方面，且對于大多數棗品種，白樺脂酸含量較高[9]。

酒精性肝損傷的發病機制比較復雜，包括酒精代謝產物引起的損傷、炎癥反應、氧化應激及脂質過氧化等[10-11]，已有研究表明北五味子木脂素[12]、靈芝三萜酸[13]及石斛多糖[14]等多種中藥提取物對酒精性肝損傷具有一定的保護作用。三萜類化合物是一種重要的中藥化學成分，其中熊果酸可通過抑制TGF-β1與其受體的結合或降低TGF-β1表達有效阻止酒精引起的肝纖維化[15]，齊墩果酸可通過干預酒精誘導的氧化應激等多種機制有效干預酒精性肝損傷[16-17]，白樺脂醇作為BA的前體物質也被證明對酒精性肝損傷具有一定的保護作用[18]，而關于BA的研究多集中于消炎[19-20]、抗癌[21-22]等方面；汪佰莉等[23]探討了BA在急性免疫性肝損傷中的作用及對細胞因子和凋亡相關蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達的影響，通過肝臟細胞實驗證明BA對小鼠急性免疫性肝損傷具有一定拮抗作用。但BA和紅棗總三萜酸（total triterpenic acids from red jujube，JTTA）保肝作用的動物實驗研究鮮見報道。

為此，本研究采用酒精性肝損傷小鼠模型，分析其肝臟指數、肝臟病理學與生化指標，探討BA與JTTA對小鼠酒精性肝損傷的保護作用及機制，為紅棗中三萜酸的進一步開發與研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明小鼠，體質量（20±2）g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供。在溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%下飼養，控制照明時間為每天12 h，給予標準普通飼料和充足的飲用水，自由進食與飲水。

紅棗采自陜西清澗，經烘箱50 ℃烘干，粉碎過40 目篩。

白樺脂酸（色譜級，純度≥98%） 南京春秋生物工程有限公司；水飛薊素膠囊 德國馬博士大藥廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉 國藥集團；二鍋頭白酒 北京紅星股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1780紫外-可見分光度儀 日本島津公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；7180型全自動生化分析儀 日本日立公司；FA1004電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；HH-8水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；E100生物顯微鏡日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 紅棗總三萜酸的制備

稱取一定量紅棗粉，先進行纖維素酶酶解，酶解條件為：加酶量1.5 mg/g，酶解時間40 min，酶解溫度60 ℃，酶解pH 4.5，然后進行超聲波輔助提取，提取條件：以80%乙醇為提取溶劑，料液比1∶25（m/V），50 ℃、400 W超聲處理20 min，重復提取2 次，過濾。濾液合并后旋轉蒸發成浸膏狀，將浸膏用蒸餾水分散，調pH值為4，以氯仿為萃取劑，采取兩相萃取法萃取，氯仿層旋轉蒸發干燥、蒸餾水分散后用D101大孔樹脂純化。純化條件：上樣pH 7，上樣體積為7 BV，洗脫劑為95%乙醇，洗脫劑pH 11，洗脫劑體積5 BV。洗脫液蒸干后得微黃色紅棗總三萜酸純化物，采用紫外-可見分光光度法，在550 nm波長處檢測吸光度，其純度可達78%。

1.3.2 小鼠酒精性肝損傷模型的建立

小鼠適應性喂養7 d后，將小鼠隨機分為正常對照組、模型組、BA低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組、JTTA組（50 mg/kg）和水飛薊素陽性對照組（50 mg/kg），每組12 只。各給藥組每天灌胃給藥一次，正常對照和模型組給予等量溶媒（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），連續6 周。小鼠每周稱質量2 次，根據體質量調整給藥量。模型組和各給藥組于第3周開始，灌胃給予二鍋頭白酒配制的30%乙醇。正常對照組給予等量溶劑。各給藥組在灌胃給藥間隔4 h以上再給予乙醇，連續4 周。

1.3.3 樣品的采集與處理

于末次灌胃后，各組小鼠禁食不禁水16 h后，對各組小鼠稱質量，摘眼球取血，收集血液，放置30 min，4 000 r/min離心15 min，分離血清于1.5 mL離心管中，4 ℃保存。小鼠頸椎脫臼處死后解剖取肝臟，用4 ℃預冷的生理鹽水沖凈表面浮血，濾紙拭干，稱質量，剪取肝左葉組織浸入4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，并于光學顯微鏡下檢查組織病理學變化；剪取剩余部分肝組織，用預冷生理鹽水沖洗并制備10%肝臟組織勻漿。

1.3.4 檢測指標及方法

1.3.4.1 一般情況觀察

實驗期間觀察小鼠的體質量變化、進食、毛發、狀態、行為及死亡情況。

1.3.4.2 小鼠肝臟指數測定

小鼠肝臟指數根據下式計算。

1.3.4.3 肝臟病理學檢查

于400 倍光學顯微鏡下觀察肝細胞的形態變化、炎癥反應、纖維化、脂肪空泡等病理改變。

1.3.4.4 生化指標的檢測

采用全自動生化分析儀測定血清中血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活力等肝功能指標與血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）濃度等脂肪代謝指標；按照試劑盒說明書進行肝勻漿MDA含量、GSH-Px、SOD活力等肝臟抗氧化能力指標測定。

1.4 數據統計分析

實驗結果以表示，采用Minitab 16.2.3軟件對數據進行統計和差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 BA、JTTA對酒精性肝損傷小鼠體質量的影響

整個實驗過程中，正常對照組小鼠狀況良好，飲食排泄均正常，體質量逐漸增加，無死亡現象。在乙醇灌胃期間，模型組、BA組、JTTA組小鼠及陽性對照組出現不同程度的異常情況。尤其是模型組小鼠行動遲緩、毛發凌亂、光澤度差，個別有脫毛現象，各劑量組和水飛薊素組小鼠狀態各有不同程度的改善。

圖1 各組小鼠體質量變化曲線Fig. 1 Body weight change in mice from different groups

各組小鼠體質量變化情況如圖1所示，灌胃酒精前，各組小鼠體質量均正常增長，且組間差異不顯著，第3周開始灌胃酒精后，模型組與對照組相比，小鼠體質量增長速率明顯減慢，灌胃后期小鼠體質量基本不再增長甚至呈下降趨勢，且在實驗結束時，模型組小鼠體質量明顯低于正常組。給藥組與模型組相比，小鼠體質量增長情況均有改善。

2.2 BA、JTTA對酒精性肝損傷小鼠肝臟指數的影響

由圖2可知，模型組小鼠的肝臟指數與對照組相比，肝臟指數升高了7.01%，差異顯著（P＜0.05），說明酒精灌胃能夠使小鼠發生肝腫脹現象，使肝臟指數升高；與模型組相比，水飛薊素組、JTTA組及BA低、中、高劑量組小鼠肝臟指數均有所降低，其中JTTA組效果最為顯著，達到了正常對照組水平，不同劑量BA處理組之間并沒有顯著性差異。

圖2 BA、JTTA對小鼠肝臟指數的影響Fig. 2 Effects of BA and JTTA on liver index

2.3 BA、JTTA對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織的影響

圖3 BA、JTTA對小鼠肝臟組織病理損傷的影響（×400）Fig. 3 Effects of BA and JTTA on pathological liver injury (× 400)

HE染色光學顯微鏡觀察結果如圖3所示，對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉內網狀纖維支架結構完整，分布規律，匯管區及其周圍無炎癥細胞浸潤，肝細胞無明顯的脂肪變性、水腫、壞死等，排列整齊。模型組小鼠肝組織病理損傷嚴重，肝細胞明顯腫脹，可見大小不一、數量不等的脂滴并伴有氣球樣變以及細胞水腫；肝小葉結構紊亂，肝索排列不規則。低劑量組與模型組相比，小鼠肝細胞氣球樣變及細胞水腫情況有所改善，但肝小葉結構仍然混亂。中、高劑量BA干預后，小鼠肝臟脂肪變性得到改善，肝臟排列較為整齊，組織結構趨于正常。而JTTA干預后，小鼠肝組織病理損傷也得到明顯改善，肝小葉結構也趨于完整。水飛薊素組小鼠肝細胞、肝小葉結構也基本正常。

2.4 BA、JTTA對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響

ALT和AST均為非特異性細胞內功能酶，是臨床上常用的肝功能評價指標[24]。正常時其在血清中的含量很低，當肝細胞損傷時，血清中ALT和AST活力會隨之發生變化，所以ALT與AST活力的高低可以在一定范圍內反映生物體內肝細胞的損傷程度[25]。

圖4 BA、JTTA對小鼠血清ALT（A）、AST（B）活力的影響Fig. 4 Effects of BA and JTTA on ALT (A) and AST (B) activities in serum

由圖4可知，同對照組比較，模型組小鼠血清的ALT、AST活力分別增加了78.58%、38.65%，顯著性升高（P＜0.05），說明成功建立模型。不同劑量BA、JTTA及水飛薊素處理后，小鼠血清的ALT、AST活力均顯著降低（P＜0.05），且BA高劑量組、JTTA、水飛薊素處理組小鼠血清的ALT、AST活力已基本達到正常水平。

2.5 BA、JTTA對酒精性肝損傷小鼠肝臟脂肪代謝的影響

肝臟發生脂肪性病變時，脂肪代謝能力下降，導致血液中TG、TC濃度上升[26]。HDL-C、LDL-C則與膽固醇在體內的運輸密切相關，濃度會隨著血液中TG、TC濃度的變化而改變[27]。

由表1可知，模型組小鼠血清的TG、TC濃度均明顯高于對照組（P＜0.05)，各樣品處理組與模型組相比，小鼠血清的TG、TC濃度顯著降低（P＜0.05)，BA低、中、高處理組小鼠血清的TG濃度分別下降了17.99%、28.04%和28.57%，小鼠血清的TC濃度分別下降了8.31%、12.23%、16.15%，表現出一定的劑量依賴型，JTTA對TG、TC濃度也表現出了明顯的抑制作用。且同對照組相比，模型組小鼠血清的HDL-C濃度明顯下降，LDL-C濃度顯著上升。BA不同劑量處理組、JTTA組及水飛薊素組小鼠血清的HDL-C水平均有不同程度升高，LDL-C濃度則有不同程度的降低，但不同劑量白樺脂酸處理組之間并沒有表現出顯著性差異，不具有明顯的劑量效應關系。

表1 BA、JTTA對小鼠血清TG、TC、HDL-C及LDL-C濃度的影響Table 1 Effects of BA and JTTA on TG, TC, HDL-C and LDL-C levels in serum mmol/L

2.6 BA、JTTA對酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力的影響

小鼠在酒精連續灌胃4 周后，機體內乙醇代謝引發多種氧化應激反應，模型組小鼠肝臟過氧化物的含量明顯升高，抗氧化能力明顯降低，而不同劑量BA處理組、JTTA組及水飛薊素組小鼠肝臟抗氧化能力有所改善。

表2 BA、JTTA對小鼠肝臟GSH-Px、SOD活力及MDA含量的影響Table 2 Effects of BA and JTTA on GSH-Px and SOD activities and MDA content in liver

由表2可知，模型組小鼠肝臟GSH-Px、SOD活力與對照組相比，顯著下降（P＜0.05）。BA低、中、高劑量處理組與模型組相比，GSH-Px活力分別提高了2.73%、35.52%、56.69%，SOD活力分別提高了3.91%、13.86%、25.45%，均表現出明顯的劑量依賴性，且高劑量組GSH-Px、SOD活力接近正常水平，JTTA組GSH-Px、SOD活力則分別提高了47.85%、19.71%，與對照組相比也無顯著性差異。

MDA作為脂質過氧化終產物[28]是反映組織損傷時出現的過強氧化作用的指標之一，組織中MDA含量越高，氧化活性越強，組織受損程度越大[29-30]。由表2可知，模型組與對照組相比，小鼠肝臟MDA含量上升了27.53%，差異顯著（P＜0.05），BA低、中、高劑量處理組與模型組相比，小鼠肝臟MDA含量分別降低了6.51%、19.25%、19.88%，中、高劑量組之間并沒有顯著性差異，JTTA組與模型組相比，小鼠肝臟MDA含量則下降了9.34%。

3 結 論

BA低、中、高劑量處理組與模型組相比，小鼠體質量增長情況有所改善，肝臟指數及肝組織結構病理損傷程度明顯降低，血清中ALT、AST活力顯著降低，表示肝功能得到一定改善；血清中TG、TC、LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著升高，說明BA能夠改善脂肪代謝功能；肝組織中MDA含量顯著降低、GSH-Px、SOD活力顯著升高，說明BA能夠增強SOD及GSH-Px的活力，提高肝臟抗氧化系統的能力，減少細胞膜脂質過氧化產物MDA的含量。

JTTA組各項指標與BA處理組具有相同的變化趨勢，肝功能與脂肪代謝功能均得到顯著改善，肝臟抗氧化能力也顯著增強。且與等劑量BA處理組相比，大部分指標表示其對酒精性肝損傷也具有同樣良好的干預作用。

BA和JTTA均可以通過降低酒精對肝臟抗氧化系統的損傷，抑制脂質過氧化達到保肝護肝的目的。紅棗中含有白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸等多種具有保肝作用的三萜酸，可以有效干預酒精性肝損傷，為將紅棗開發為保肝護肝保健食品提供科學依據。

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