降香內生真菌代謝產物對H2O2誘導的HepG2細胞氧化損傷保護作用

高 原，王福玲，賈 琦，劉 微，周艷巖，張曉萌，咸玥桐

（哈爾濱商業大學藥學院，細胞與分子生物學研究所，黑龍江 哈爾濱 150076）

降香檀（Dalbergia odorifera T. Chen）為豆科檀屬植物，別名降香、花梨木，是國家二級保護植物[1-3]。降香檀（簡稱降香）的樹干和根的干燥心材降香為我國傳統中藥，多用于脘腹疼痛，跌撲損傷，外傷出血的治療，常與其他活血化瘀藥配伍用于心血管疾病的治療[4-6]。降香的主要化學成分為揮發油類和黃酮類化合物。現代藥理學研究表明其成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗高血脂、舒張血管、抑制中樞神經系統以及抑制白細胞三烯生物合成等作用[7-10]。降香資源日益緊缺，生長周期長，分布受到地域限制并在一定程度上受環境的影響。如果直接以降香為研究對象，從降香中提取分離活性成分，會面臨著破壞植物資源、采集困難、耗時耗力等諸多難題。為了解決這些問題，本研究將目光轉向降香內生真菌。內生真菌作為豐富的次生代謝產物的天然藥庫，有著巨大的開發潛能。如果利用植物內生真菌發酵生產活性次生代謝產物，能夠降低成本、節約資源，對保護環境亦有重大貢獻。

自由基是生物體內生命活動的一種正常代謝產物，當機體處于正常情況下，體內自由基的產生和消除處于一種動態的平衡狀態[11-12]，然而當某種原因打破這種動態的平衡后，自由基就會導致組織細胞的氧化損傷并引發多種疾病[13-14]。這種過氧化反應在某些化合物的作用下，是可以逆轉的，抗氧化劑即能防止這一現象的產生。由于人工合成抗氧化劑在生物體內沉降積累，不易分解，容易對機體造成損傷，所以天然抗氧化劑的開發和應用越來越受到人們的關注。丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）是肝細胞脂質過氧化反應的終產物，MDA的測定可以用于評價氧自由基介導的細胞損傷。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，其活力反應機體清除氧自由基的能力。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）能夠有效清除脂質和其他的有機氫過氧化物，是氧化應激中發揮保護作用的重要酶[15-17]。以上酶及相關產物的檢測往往是抗氧化活性評價的重要指標。

本研究通過從降香中分離內生真菌，并初步篩選獲得一株抗氧化活性較好的菌株，并對其進行分類鑒定。擬通過構建HepG2細胞氧化損傷模型，觀察降香內生真菌代謝產物對HepG2細胞氧化損傷的保護作用，為探討其抗氧化損傷機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

降香新鮮植株，購自廣東省廣州市老果農實驗基地；HepG2細胞，哈爾濱商業大學細胞與分子生物學研究所保存。

染料木素標準品（純度≥98%） 上海伊卡生物技術有限公司；白藜蘆醇（純度≥98%） 西安玉泉生物科技有限公司；氨芐青霉素 美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 北京中生瑞泰科技有限公司；MDA、SOD和GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所；次氯酸鈉 西隴化工股份有限公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸粉 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖 天津市天力化學試劑有限公司；氯化鈉國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；HH-2型恒溫水浴箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；電熱鼓風干燥箱、生化培養箱、BP-9082型精密恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；BSA6202S-CW電子分析天平、PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-12CD型光學顯微鏡上海滬杏光學儀器有限公司；1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Agilent公司；AB Sciex API3000質譜（mass spectrometry，MS）儀（三重四極桿串聯MS檢測器）美國SCIEX公司；ELx800酶標儀 美國BioTek公司；CO2培養箱 德國Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 降香內生真菌的分離與培養

新鮮降香樹皮，洗滌劑洗凈表面污垢，清水沖洗。無菌條件下進行組織表面消毒：75%的乙醇100 mL浸泡1 min，無菌水漂洗2～3 次，10%的NaClO 100 mL溶液分別浸泡5 min，無菌水100 mL漂洗2～3 次，每次1 min，最后用無菌濾紙吸干表面水分，備用[18-19]。將降香樹皮用鑷子撕下并剪成適宜大小的組織塊，放置于氨芐青霉素終質量濃度為100 μg/mL的PDA培養基上，30 ℃培養3～10 d，以最后一次無菌水涂抹印記作為陰性對照。待長出真菌后，挑去尖端菌絲，反復純化，保存備用。

將已純化的降香內生真菌菌種活化后，接種于200 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，30 ℃搖床培養2 周后，菌種4 層紗布過濾后烘干，乙酸乙酯浸提，發酵培養液乙酸乙酯萃取后，二者合并后濃縮得浸膏，溶于1 mL甲醇備用。

1.3.2 降香內生真菌的抗氧化活性篩選

通過DPPH清除自由基實驗對降香內生真菌代謝產物的抗氧化活性進行篩選。按下式計算DPPH自由基清除率。用無水乙醇做空白對照[20]。

式中：Ac為無水乙醇+DPPH的吸光度；A0為樣品+無水乙醇+DPPH的吸光度。

1.3.3 降香內生真菌的鑒定

真菌總DNA提取采用CTAB法[21]，以ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）為引物，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）獲得ITS-rDNA擴增片段[22-23]。PCR體系（50 μL）：5 μL 10×PCR buffer、4 μL 25 mmol/L MgCl2、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、5 μL 0.5 μmol/L上游引物、5 μL 0.5 μmol/L下游引物、0.2 μL 5 U/μL Taq酶、26.8 μL無菌去離子水。PCR擴增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環。DNA片段回收純化后送往上海生物工程有限公司測序，所得結果在GenBank上進行同源性比對，并利用軟件MEGA 5.0構建系統發育樹，確定菌株分類地位[24]。

1.3.4 降香內生真菌代謝產物檢測

精確稱量內生真菌乙酸乙酯萃取物溶于色譜甲醇，質量濃度為10 μg/mL，0.22 μm濾膜過濾。采用HPLCMS/MS法檢測[25]。色譜條件：色譜柱：HiQ SiL C18柱，250 mm×4.6 mm；流動相：甲醇-水（含1%的甲酸），梯度洗脫：91%甲醇0～10 min，91%～57%甲醇10～25 min，57%～91%甲醇25～40 min；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL，用染料木素標準品做對照。質譜條件：離子源為ESI源，多反應監測負離子掃描，離子噴霧電壓-4 500 V，去簇電壓、碰撞電壓、入口電壓和出口電壓分別為-60、-25、-10、-5 V。用于分析的染料木素離子質荷比（m/z）為269.1～133.0。

1.3.5 內生真菌產物對H2O2誘導肝細胞抗氧化酶活力等指標的影響

取處于對數生長期的HepG2細胞接種于6 孔培養板，每孔1×104細胞，培養約12 h后，分為陰性對照組、陽性對照組和不同質量濃度的內生真菌代謝產物組。陰性對照組不加受試物；陽性對照組只加入200 μmol/L H2O2干預6 h，內生真菌代謝產物組分別加入的質量濃度為0、1、5、10、20、40 μg/mL預處理12 h，各代謝產物組再加入200 μmol/L H2O2作用6 h，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。干預結束后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗2 次，然后每孔加入1% Triton100的磷酸鹽緩沖液0.5 mL，細胞裂解液裂解細胞后2 000 r/min離心10min取得上清液，參照試劑盒要求，測定細胞中MDA水平、SOD、GSH-Px活力等相關氧化損傷的指標[26-28]。陽性對照藥選取白藜蘆醇（0～40 μg/mL）。

1.4 數據統計分析

應用SPSS統計軟件包進行數據統計學處理。采用方差分析并行方差齊性檢驗；結果以表示。

2 結果與分析

2.1 降香內生真菌的分離及抗氧化活性篩選

通過組織表面消毒法初步從降香樹皮部分離獲得內生真菌83 株，通過DPPH自由基清除率實驗，對稀釋不同倍數（0.031×、0.063×、0.13×、0.25×、0.50×和1.00×）的內生真菌發酵濃縮液進行了檢測，初步篩選獲得了一系列抗氧化活性較好的內生真菌，其中內生真菌JXP21抗氧化活性最佳，計算得其半數抑制濃度為0.052×內生真菌濃縮液。

2.2 降香內生真菌的鑒定

圖1 降香內生真菌JXP21 ITS序列系統進化樹發育分析Fig. 1 Phylogenetic tree analysis of endophyte JXP21 based on ITS sequence

通過對菌株JXP21進行DNA的提取及PCR擴增回收，測序獲得菌株JXP21的ITS-rDNA序列，用BLAST與GenBank數據庫中的序列比較，從中獲得與該菌株序列相近種屬的ITS-rDNA序列，構建系統發育樹。結合真菌形態學及分子生物學比對結果（圖1），菌株JXP21鑒定為鏈格孢菌（Alternaria alternata），與Alternaria alternata（KP979753.1）具有100%的相似性。

2.3 降香內生真菌代謝產物的檢測

圖2 降香內生真菌JXP21次生代謝產物的HPLC-MS/MS檢測Fig. 2 HPLC-MS/MS analysis of secondary metabolites from JXP21

圖3 降香內生真菌JXP21次生代謝產物的MS檢測Fig. 3 Mass spectra of secondary metabolites from JXP21

采用HPLC-MS/MS成對捕捉檢測結果顯示，在內生真菌JXP21的乙酸乙酯層中，檢測出了染料木素，出峰時間為14.74 min，m/z 269.1～133.0（圖2），一級、二級質譜圖如圖3所示。染料木素（genistein）為異黃酮的一種，它具有弱雌激素活性、抗癌、預防心血管疾病等功能，此外，還具有抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制真菌活性及酪氨酸蛋白激酶活性的功能[29-30]，通常存在豆科植物中，也在降香中存在。在內生真菌代謝產物中檢測得到染料木素可能與其宿主環境的影響有關，內生真菌JXP21的抗氧化活性也可能受到染料木素的影響。

2.4 降香內生真菌萃取物對H2O2誘導HepG2細胞抗氧化酶活力的影響

圖4 降香內生真菌代謝產物對HepG2細胞MDA水平的影響Fig. 4 Effect of metabolites from JXP21 on MDA level in HepG2 cells

圖5 降香內生真菌代謝產物對HepG2細胞SOD活力的影響Fig. 5 Effect of metabolites from JXP21 on SOD activity in HepG2 cells

圖6 降香內生真菌代謝產物對HepG2細胞GSH-Px活力的影響Fig. 6 Effect of metabolites from JXP21 on GSH-Px activity in HepG2 cells

與空白對照組比較，H2O2誘導模型組細胞懸液中SOD活力明顯降低，GSH-Px活力明顯下降，MDA水平明顯升高。內生真菌代謝產物作用于HepG2細胞后，與模型組相比，能夠降低H2O2誘導損傷引起的MDA含量的升高，MDA含量由4.65 nmol/mg pro下降為3.68 nmol/mg pro。提高SOD和GSH-Px活力，SOD活力由6.88 U/mg pro升高至8.64 U/mg pro，GSH-Px活力由8.45 U/mg pro升高至9.68 U/mg pro。且變化趨勢均呈明顯的劑量依賴性（圖4～6）。與陽性對照白藜蘆醇（0～40 μg/mL）結果呈現一致性，白藜蘆醇作用HepG2細胞后，MDA含量下降1.82 nmol/mg pro，SOD活力上升1.53 U/mg pro，GSH-Px活力上升2.13 U/mg pro。

3 結 論

本實驗通過組織表面消毒法，從降香樹皮中分離出大量內生真菌，初步篩選獲得一株具有良好抗氧化活性的降香內生真菌JXP21。通過分子生物學方法，對內生真菌JXP21進行了鑒定，系統發育分析初步判定JXP21為鏈格孢菌。進一步對JXP21擴大培養，富集純化代謝產物，通過HPLC-MS/MS檢測，初步檢測出一種活性成分——染料木素，推測該菌株活性與該化合物有一定的關系。在內生真菌JXP21代謝產物對H2O2誘導的HepG2細胞氧化損傷的保護作用研究中表明，適當質量濃度的降香內生真菌JXP21代謝產物能抑制H2O2所誘導的細胞氧化應激損傷，JXP21代謝產物對H2O2所致的肝細胞損傷有明顯的抗氧化作用，能夠提高HepG2細胞的SOD和GSH-Px的活力，降低MDA含量，表明內生真菌JXP21代謝產物對肝細胞具有一定的保護作用。關于內生真菌及其次生代謝產物的研究目前已經較為成熟，但是關于降香內生真菌及其代謝產物的研究目前報道較少，對降香這種國家二級保護植物的內生真菌的分離培養，不僅為降香資源的開發和利用提供了新途徑，也為該藥用植物及其其內生真菌之間的關系提供了一定的理論依據。本課題組也將繼續對降香內生真菌的次級代謝產物進行研究與探討，對次生代謝產物的抗氧化機制進一步深入的研究。

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