MgSO4處理對西蘭花芽苗菜生理活性物質和抗氧化能力的影響

初 婷，彭 暢，郭麗萍*

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

流行病學研究表明，經常攝入西蘭花、甘藍等十字花科蔬菜有助于預防肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌等癌癥的發生[1]，這主要是因為在這些蔬菜中含有豐富的硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷），其在黑芥子酶的作用下生成的異硫氰酸酯通過抑制體內Ⅰ相致癌酶的產生，誘導產生Ⅱ相解毒酶并增強其活性，從而起到預防和治療癌癥的作用[1]。此外，異硫氰酸酯還具有抑菌、抗氧化、抗炎及預防心血管疾病等作用[2]。硫苷根據側鏈結構可以分為脂肪族、芳香族和吲哚族硫苷[3]。

研究表明，西蘭花中脂肪族硫苷含量較多，占總硫苷的70%左右，其中蘿卜硫苷含量最多，占硫苷總量的50%以上[4]；西蘭花芽苗菜中硫苷含量是成熟西蘭花的10～100 倍[5]。蘿卜硫苷的降解產物蘿卜硫素是目前發現的抗癌作用最強的異硫氰酸酯[6]，引起了國內外的廣泛關注，因此西蘭花芽苗作為一種新型的具有保健功能的蔬菜和功能食品原料具有廣闊的前景。此外，西蘭花芽苗菜中還含有豐富的酚類物質、花色苷和抗壞血酸等，它們都是重要的抗氧化物質，能夠消除體內過多的自由基[7]。

隨著西蘭花芽苗菜生理活性的進一步證實[8]，如何提高西蘭花芽苗菜中生物活性物質的積累已成為研究熱點。硫苷作為十字花科中一種特有的含硫物質，有學者試圖通過硫肥的添加而提高植物中硫苷含量。Yang Runqiang等[9]研究了含硫化合物K2SO4、ZnSO4和甲硫氨酸等對西蘭花芽苗生理活性物質的影響，發現ZnSO4處理后西蘭花芽苗生長受到抑制，但其中的總硫苷、總酚、異硫氰酸酯和抗壞血酸物質的含量顯著增加，黑芥子酶活力也顯著提高。Aires等[10]對西蘭花芽苗同時施加K2SO4和KCl，但并未發現硫苷含量有所增加，其中的總酚、抗壞血酸等物質含量也無顯著變化。當抗壞血酸存在時，Mg2+可以提高黑芥子酶活性，從而促進硫苷分解生成異硫氰酸酯[11]。MgSO4作為植物生長過程中常用的肥料，對于西蘭花芽苗菜中抗壞血酸、總酚、硫苷和異硫氰酸酯的富集以及抗氧化能力的影響鮮見報道。

本實驗在西蘭花種子發芽過程中，通過外源噴施25、50 mmol/L和75 mmol/L的MgSO4溶液，研究西蘭花芽苗菜在發芽5 d和8 d時的生長狀況和葉綠素、硫苷、異硫氰酸酯、總酚、抗壞血酸含量以及黑芥子酶活力、抗氧化能力的變化，為西蘭花芽苗菜的工業化生產及相應功能性食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花種子購于杭州三雄種苗有限公司。

蘿卜硫素標準品、硫酸酯酶、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；二氯甲烷、沒食子酸、福林-酚試劑、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸鎂 國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；乙腈（色譜純） 上海陸都化學試劑廠；葡萄糖測定試劑盒 南京建成生物工程公司。

1.2 儀器與設備

UV-2000紫外可-見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AE100電子天平 上海天達儀器有限公司；TDL-5離心機 上海安亭科學儀器廠；1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫公司；光照培養箱 上海高致精密儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 龍口市先科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 西蘭花種子發芽方法

將西蘭花種子用次氯酸鈉消毒后，用蒸餾水洗至中性，于30 ℃恒溫水浴鍋中浸泡4 h。浸泡后的西蘭花種子均勻播種于鋪有蛭石的4 個小盒中，置于帶有自動噴霧的發芽機中，于25 ℃條件下發芽（16 h光照、8 h黑暗），1 d后，停止噴霧，每天噴施MgSO4溶液20 mL，濃度分別為25、50、75 mmol/L，以噴施蒸餾水作為對照，分別于發芽5、8 d后取樣測定。

1.3.2 芽苗菜芽長與鮮質量的測定

將每個濃度的西蘭花芽苗都隨機抽取30 根芽苗為一個樣本，測量其長度，并稱質量，計算每根芽苗的質量。

1.3.3 葉綠素含量的測定

按王學奎[12]的方法，取1.0 g西蘭花芽苗加入10 mL 95%的乙醇溶液研磨至組織變白，靜置5 min后過濾，以95%乙醇為空白，在波長665 nm和649 nm處測定吸光度。按式（1）計算葉綠素含量。

式中：V表示葉綠素提取的體積/mL；m表示樣品的質量/g。

1.3.4 總硫苷含量的測定

根據Tian Ming等[13]的方法。取0.5 g西蘭花芽苗，加入3.0 mL蒸餾水研磨均勻，于37 ℃水浴酶解反應1 h以使硫苷完全被內源黑芥子酶酶解；同時，另取一份樣品，加入3.0 mL酸化甲醇研磨成勻漿后，于80 ℃加熱5 min滅酶，以此為對照。然后向樣品中加入2.0 mL 100%甲醇和2～3 mg活性炭，使其中的多酚類化合物沉淀后，10 000×g離心10 min，收集上清液。用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量，由硫苷分解生成的葡萄糖的物質的量與硫苷的物質的量相等，以此計算硫苷物質的量，結果以鮮質量計，單位為μmol/g。

1.3.5 黑芥子酶活力的測定

黑芥子酶活力的測定按郭麗萍等[14]的方法。以每分鐘被黑芥子酶轉化生成1 nmol葡萄糖為1 個酶活力單位，酶活力單位為U/mg。

1.3.6 蘿卜硫素含量的測定

根據參考文獻[14]的方法。取0.5 g西蘭花芽苗菜，加4 mL蒸餾水研磨，利用內源酶進行酶解后，加入二氯甲烷萃取，蒸干二氯甲烷后用體積分數10%乙腈溶解，進HPLC分析。檢測波長為254 nm，紫外檢測器，流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃。洗脫程序：0 min～25 min～30 min，乙腈洗脫體積分數為10%～60%～100%。結果以mg/g鮮質量表示。

1.3.7 抗壞血酸含量的測定

采用王志英等[15]的方法測定抗壞血酸的含量。用20 g/L草酸提取西蘭花芽苗菜中抗壞血酸，然后用HPLC進行分析測定。SB-C18色譜柱；檢測波長254 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相為V（0.1%草酸）∶V（甲醇）＝95∶5。結果以鮮質量表示。

1.3.8 總酚含量的測定

總酚含量的測定參考文獻[14]的方法。稱取0.2 g西蘭花芽苗菜，加入50%甲醇研磨勻漿后離心，取上清液1 mL，加入1 mL福林-酚試劑、2 mL 20 g/L Na2CO3，暗處反應2 h，于765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸作標準曲線，結果以鮮質量表示。

1.3.9 H2O2清除率的測定

H2O2清除率的測定參考文獻[16]。稱取0.5 g的西蘭花芽苗，加入5.0 mL 50%乙醇進行研磨，將勻漿液10 000×g離心15 min，取上清液1 mL，加入4 mL 10 mmol/L的H2O2溶液，用蒸餾水定容至100 mL，在248 nm波長處測定吸光度（A1）；同時測定不加樣品的H2O2溶液（A0）和不加H2O2溶液的樣品（A2）的吸光度。H2O2清除率按式（2）計算。

1.3.10 DPPH自由基清除率的測定

取1.0 mL 1.3.9節的上清液，與0.3 mL 40 μmol/L DPPH無水乙醇溶液、2.0 mL蒸餾水混合，搖勻后于室溫下避光放置30 min，于517 nm波長處測定吸光度（A1）。同時測定不加樣品的DPPH無水乙醇溶液的吸光度（A0）和不加DPPH無水乙醇溶液的樣品液的吸光度（A2）。DPPH自由基清除率按式（3）計算。）

1.4 數據分析

實驗設3 次重復，各指標重復測定3 次，結果以表示。實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，均值間比較采用Duncan’s多重比較，在0.05水平上進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜芽長與鮮質量的影響

圖1 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜芽長（A）和鮮質量（B）的影響Fig. 1 Effect of MgSO4 treatment on sprout length (A) and fresh weight (B) of broccoli sprouts

圖1結果表明，MgSO4對西蘭花芽苗菜造成了一定的脅迫作用，降低了其產量。25 mmol/L MgSO4處理下，西蘭花芽苗菜芽長和鮮質量與對照組相比均無顯著差異，雖然不同濃度處理組芽苗菜在發芽5 d時的芽長與對照組相比下降（圖1A），但是鮮質量卻與對照組無顯著差異（圖1B）；與對照組相比，在發芽8 d時50 mmol/L MgSO4處理組芽苗菜的芽長和鮮質量分別降低12.6%和10.8%，75 mmol/L MgSO4處理組分別降低23.3%和18.6%。

2.2 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜葉綠素含量的影響

圖2 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜葉綠素含量的影響Fig. 2 Effect of MgSO4 treatment on chlorophyll content in broccoli sprouts

如圖2所示，發芽5 d和8 d時，不同濃度MgSO4處理組西蘭花芽苗菜中葉綠素含量無顯著性差異。MgSO4處理顯著提高了西蘭花芽苗菜中葉綠素含量，葉綠素含量隨著MgSO4濃度的增大逐漸增加； 25、50 mmol/L和75 mmol/L MgSO4處理組西蘭花芽苗菜中葉綠素含量在發芽5 d時分別較對照組增加29.0%、44.0%和67.3%；在發芽8 d時，分別增加25.1%、41.9%和60.1%。

2.3 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜總硫苷含量的影響

圖3 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜總硫苷含量的影響Fig. 3 Effect of MgSO4 treatment on total glucosinolate content in broccoli sprouts

圖3結果表明，發芽8 d的西蘭花芽苗菜中總硫苷含量顯著低于發芽5 d的，MgSO4處理顯著提高了西蘭芽苗菜中總硫苷含量。隨著MgSO4濃度的增大，總硫苷含量先增加后降低，經50 mmol/L MgSO4處理后芽苗菜中總硫苷含量最高；50 mmol/L MgSO4處理組的芽苗菜，總硫苷含量在發芽5、8 d時分別是對照、25、75 mmol/L MgSO4處理組的1.42、1.21、1.08 倍和1.93、1.33、1.06 倍；在50 mmol/L MgSO4處理下，發芽8 d時的芽苗菜較發芽5 d時總硫苷含量下降了25.08%。

2.4 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜黑芥子酶活力的影響

圖4 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜黑芥子酶活力的影響Fig. 4 Effect of MgSO4 treatment on myrosinase activity in broccoli sprouts

由圖4可知，MgSO4處理顯著提高了黑芥子酶活力，對于發芽時間相同的芽苗菜，50 mmol/L和75 mmol/L MgSO4處理組之間無顯著差異。在50 mmol/LMgSO4處理下，發芽5 d和8 d芽苗菜的黑芥子酶活力分別是對照組的1.83 倍和1.41 倍；0、25、50 mmol/L和75 mmol/L MgSO4處理后，發芽8 d的西蘭花芽苗菜中黑芥子酶活力分別是發芽5 d的2.06、1.69、1.59 倍和1.59 倍。

2.5 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜蘿卜硫素含量的影響

從圖5可知，對于相同濃度MgSO4處理組，發芽8 d的西蘭花芽苗菜中蘿卜硫素含量顯著低于發芽5 d的；MgSO4處理顯著提高了芽苗菜中蘿卜硫素含量，但對于發芽時間相同的芽苗菜，50 mmol/L和75 mmol/L MgSO4處理組之間無顯著差異；50 mmol/L MgSO4處理下，發芽5 d和8 d的芽苗菜中蘿卜硫素含量分別較對照組增加了54.5%和68.2%。

圖5 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜蘿卜硫素含量的影響Fig. 5 Effect of MgSO4 treatment on sulforaphane content in broccoli sprouts

2.6 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜總酚和抗壞血酸含量的影響

圖6 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜總酚（A）和抗壞血酸（B）含量的影響Fig. 6 Effect of MgSO4 treatment on the contents of total phenoics (A)and ascorbic acid (B) in broccoli sprouts

西蘭花芽苗菜中總酚含量隨著MgSO4濃度的增加不斷增加（圖6A），且發芽5 d的芽苗菜中總酚含量高于發芽8 d的；25、50 mmol/L和75 MgSO4處理下，發芽5 d的芽苗菜中總酚含量分別較對照組高15.4%、47.7%和66.9%，而發芽8 d的芽苗菜中總酚含量分別較對照組高32.8%、78.3%和109.6%。與此相反，經MgSO4處理后，抗壞血酸含量卻顯著降低（圖6B），對照組和25 mmol/L MgSO4處理組芽苗菜在發芽5 d和8 d時抗壞血酸含量無顯著差異；50 mmol/L和75 mmol/LMgSO4處理組芽苗菜在發芽8 d時時抗壞血酸含量高于發芽5 d的；75 mmol/L MgSO4處理組在發芽5 d和8 d時抗壞血酸含量分別比對照組低48.9%和28.7%。

2.7 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜DPPH自由基清除率和H2O2清除率的影響

圖7 MgSO4處理對西蘭花芽苗菜DPPH自由基清除率（A）和H2O2清除率（B）的影響Fig. 7 Effect of MgSO4 treatment on scavenging capacity against DPPH radical (A) and H2O2 (B) of broccoli sprouts

圖7A結果表明，菜在發芽5 d的西蘭花芽苗清除DPPH自由基的能力顯著高于發芽8 d的，經MgSO4處理后，清除DPPH自由基的能力顯著增強，但50 mmol/L和75 mmol/L MgSO4處理組之間無顯著差異；50 mmol/L MgSO4處理組芽苗菜在發芽5 d和8 d時，其DPPH自由基清除率分別是對照組的1.7 倍和1.6 倍，發芽5 d的芽苗菜DPPH自由基清除率較發芽8 d的提高28.1%。而西蘭花芽苗菜的H2O2清除率隨著MgSO4濃度的增加逐漸增強，25、50 mmol/L和75 mmol/L MgSO4處理組在發芽5 d和8 d時，對DPPH自由基清除率分別是對照組的1.17、1.37、1.59 倍和1.24、1.55、1.76 倍。

3 討 論

有活力的種子經吸水后開始萌發，期間發生了一系列生理生化變化，如淀粉、蛋白質水解，大分子物質合成，亞細胞結構變化和細胞伸長等。西蘭花芽苗菜噴施不同濃度的MgSO4溶液處理后，發芽5 d芽苗菜的生長無顯著變化，顯著降低了發芽8 d芽苗菜的芽長和鮮質量；表明過量的MgSO4溶液對西蘭花芽苗菜造成脅迫效應，作用大小與噴施時間和濃度有關。鎂是葉綠素卟啉環位于中央位置的一個具有螯合效應的中心金屬元素，它是形成葉綠素結構的重要元素，且MgSO4能顯著提高大豆根系的葉綠素含量[17]，本實驗也得到相似的結果，MgSO4顯著提高了西蘭花芽苗菜中葉綠素含量。

Falk等[18]研究表明，植物中30%的硫來源于硫苷，給植物施用硫肥，其可以以硫的形式進入到植物體內，對于硫苷的合成起到了很大的幫助；然而，當植物缺乏硫時，其中的硫苷就會被分解，產生的硫以硫源形式合成其他含硫的物質或者供給植物生長，這大大降低了硫苷的含量。植物在生長過程中，伴隨著硫苷的合成與分解，硫苷含量逐漸下降[19]，本研究中發芽8 d西蘭花芽苗菜中總硫苷含量也顯著低于發芽5 d芽苗菜，主要是因為隨著芽苗菜的生長硫苷在芽苗中得到稀釋。當植物遭受適當的脅迫（如熱激、低氧、NaCl等）[20-21]或添加外源物質（茉莉酸、油菜素內酯、蔗糖、茉莉酸甲酯）[22-24]時，硫苷作為植物中重要的次生代謝產物，其含量會得到積累；但是當脅迫作用到一定程度后，次生代謝產物含量不會繼續增加[20]。本研究中，總硫苷含量經MgSO4處理后顯著增加，50 mmol/L MgSO4處理時達到最高，且與75 mmol/L MgSO4處理組之間無顯著差異。一方面的原因可能是MgSO4對西蘭花芽苗造成的脅迫效應，使硫苷含量得到積累；另一個原因可能是MgSO4作為硫源，促進了硫苷的合成，但具體機理有待于進一步闡明。

硫苷在黑芥子酶的作用下，生成異硫氰酸酯等化合物，蕓薹屬植物中存在表皮特異硫蛋白，其可以使硫苷朝著腈類物質的方向水解，從而降低異硫氰酸酯含量，而腈類物質是沒有抗癌等生物活性的[25]。因此，硫苷的含量和黑芥子酶的活性對于異硫氰酸酯的形成至關重要。黑芥子酶活性的變化與植物的種類和品種密切相關，在發芽5 d的甘藍芽苗菜中黑芥子酶活力先增大后減小[15]，發芽5 d的蘿卜芽苗菜中黑芥子酶活力高于發芽3 d和7 d的芽苗菜[26]，而西蘭花芽苗菜在發芽的7 d內，黑芥子酶活力隨發芽時間的延長逐漸增強[14]。本研究中，發芽8 d的西蘭花芽苗菜中黑芥子酶活力顯著高于發芽5 d的。研究發現，單獨的Mg2+存在時，黑芥子酶活力無顯著變化，但當與抗壞血酸共存時，能顯著提高黑芥子酶活力從而提高異硫氰酸酯的形成[11]。抗壞血酸可以使黑芥子酶的活性中心構象發生變化從而改變其活力，低濃度的抗壞血酸能夠提高黑芥子酶活力，但是當濃度過高時會抑制酶活力使異硫氰酸酯含量降低[27-28]。本實驗中，MgSO4顯著提高了西蘭花芽苗菜的黑芥子酶活力，可能是在抗壞血酸的存在下，Mg2+聯合抗壞血酸使得黑芥子酶活力增加。蘿卜硫素是西蘭花芽苗菜中含量最高的異硫氰酸酯，占總量的67%左右[14]。本研究中，蘿卜硫素的變化趨勢與硫苷變化趨勢基本一致，50 mmol/L MgSO4處理組西蘭花芽苗菜中蘿卜硫素含量最高；雖然發芽8 d的芽苗菜中黑芥子酶活力高于發芽5 d的，由于其底物總硫苷含量在發芽5 d的芽苗菜中較高，因此導致發芽5 d的芽苗菜總有較高的異硫氰酸酯含量。

本研究中，隨著MgSO4濃度的增加，抗壞血酸的含量減低，這與Guo Liping等[21]用NaCl處理西蘭花芽苗菜的結果相似，一種原因可能是一部分抗壞血酸作為抗氧化物質抵御MgSO4造成的脅迫效應，另一個原因可能是抗壞血酸合成過程中重要的酶——L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶活性降低所致。NaCl等脅迫可以提高植物中酚類物質等次生代謝產物的含量，而當脅迫達到一定程度后，次生代謝產物含量不會進一步增加[21]。本實驗中MgSO4也對西蘭花芽苗菜造成一定的脅迫效應，因此使酚類物質得到積累以抵御脅迫?？偡?、抗壞血酸是西蘭花芽苗菜中重要的抗氧化物質，硫苷和蘿卜硫素也具有一定的抗氧化作用[7,29]。雖然抗壞血酸含量經MgSO4處理后顯著下降，但硫苷、蘿卜硫素和總酚的含量顯著增加，因此西蘭花芽苗菜經MgSO4處理后清除DPPH自由基和H2O2的能力均顯著提高。

4 結 論

西蘭花芽苗菜經MgSO4處理后，發芽8 d的芽苗菜生長受到抑制，芽長和鮮質量顯著下降。葉綠素含量隨MgSO4濃度的增大逐漸增加，但發芽5 d和8 d的芽苗菜之間無顯著差異。發芽5 d的芽苗菜中總硫苷含量顯著高于發芽8 d的，但發芽8 d芽苗菜的黑芥子酶活力高于發芽5 d的；MgSO4處理顯著提高了芽苗菜中總硫苷含量、黑芥子酶活力，但是50 mmol/L和75 mmol/L MgSO4處理組之間差異不顯著，蘿卜硫素含量的變化趨勢與總硫苷含量一致?？偡雍侩SMgSO4濃度的增大逐漸增加，而抗壞血酸含量卻逐漸降低；MgSO4處理顯著提高了西蘭花芽苗菜清除DPPH自由基和H2O2的能力。這些結果為西蘭花芽苗菜的開發和利用提高了科學的理論依據。

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