不同麥汁濃度對Lager啤酒酵母氨基酸代謝及發酵性能的影響

趙伯辰，張 柯，雷宏杰，徐懷德

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

啤酒高濃釀造不僅會產生很大的經濟效益，在一定程度上還可提高啤酒的質量[1]。18°P麥汁發酵的高級醇生成量顯著高于12°P麥汁發酵的高級醇生成量，醇酯比增大[2]。這樣，將高濃發酵后的啤酒稀釋至常濃時，依然可保證啤酒豐滿圓潤，口感柔和協調。但是，高濃釀造在生產中也存在許多問題，如：高濃形成的高滲透壓和高乙醇毒性抑制酵母的生長，使得發酵緩慢[3-6]，增加了酵母壓力；降低了原料的利用率（酒花的利用率下降）和啤酒泡沫穩定性[7]；造成啤酒風味差異，不協調[8-9]；影響了酵母的發酵性狀和絮凝性等[10]，并降低了酵母回收再利用率。產生這些不良效果的根本原因在于發酵過程中可同化氮源的不足。

氮源作為酵母細胞生長和代謝所必需的元素之一，在酵母生長、繁殖過程中扮演著重要的角色。酵母的生長伴隨著氮源的消耗，酵母停止繁殖，氮源的利用就會相應降低甚至停滯。高濃麥汁中α-氨基氮的含量不僅對酵母適應高滲透壓有影響，還會對乙醇生產速率和乙醇耐受性有一定的影響，高濃度的α-氨基氮可增加酵母對高滲透壓的適應能力和乙醇的耐受性。酵母細胞的氮代謝活動主要有胞內氨基酸的生物合成和結構蛋白及各種酶類的合成等[11]。在發酵初期，麥汁中大量的含氮物質被快速利用，24 h之后利用變緩，直至酵母細胞停止生長[12]。常濃釀造麥汁中總FAN水平與酵母生長成正比，即麥汁中高的FAN水平可導致酵母細胞的快速增長，并影響啤酒的成熟[13]，初始FAN水平與最終乙醇產量之間也存在顯著相關性[14]。因此，確保麥汁中豐富的FAN對于良好及快速的發酵具有非常重要的意義。氨基酸作為重要的可同化氮源不僅參與細胞內各物質的代謝[15]并提高啤酒非生物穩定性，而且部分氨基酸還可調控啤酒酵母細胞適應高滲透壓和高乙醇毒性，從而提高酵母的發酵性能。

本試驗研究不同濃度全麥芽麥汁，即不同氮源水平對啤酒酵母生理特性和發酵性能的影響，探究啤酒高濃釀造中豐富的氮源與酵母生長、細胞活性、乙醇產量、發酵度及其與啤酒風味物質等的關系，確定在高濃釀造中能夠調控酵母細胞適應高滲透壓環境脅迫的關鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：Lager啤酒酵母Saccharomyces pastorianus，由西北農林科技大學食品工程實驗室提供。該菌種經UV照射和甲基磺酸乙酯復合誘變后在含有高濃度麥芽糖和乙醇的培養基上進行馴化培養獲得。

麥汁制備：稱取一定量的麥芽（澳麥芽，購買于廈門市老啤匠貿易有限公司），經粉碎機粉碎后裝入糖化鍋內，按照麥芽與水的質量比為1∶4加入45℃釀造水，攪拌均勻，用乳酸調至pH5.5。設置升溫程序依次為：45 ℃，30 min；63 ℃，60 min；72℃，10 min；78℃，10 min。以1℃/min的速度升溫，開始糖化，糖化結束后迅速冷卻至45℃進行濾布過濾，再將濾液煮沸90 min，煮沸過程中分3次添加酒花顆粒（由西安雪花啤酒有限公司提供），添加量為麥芽質量的0.1%。煮沸結束后再次用紗布過濾，將濾液用釀造水分別定型至8 °P、12 °P、16 °P、20°P、24°P，得到不同濃度的全麥芽麥汁。發酵前進行高壓蒸汽滅菌（121℃，15 min）。

試劑：果糖、瓊脂、麥芽糖漿，厚樸生物科技（蘇州）有限公司；高級醇酯標準品、甘氨酸，美國Gen-Probe公司；亞甲基藍、茚三酮，南京化學試劑股份有限公司；無水乙醇、氯化鈉、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O，國藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：ISQ&TRACE ISQ氣相質譜聯用儀，美國賽默飛科技有限公司；Waters UPLCI-Class型高效液相色譜儀，美國沃特斯公司；DYJX-80℃冰箱，鼎耀機械有限公司；UV1780紫外可見分光光度計，日本島津公司；TS-1102C小型立式恒溫振蕩箱，上海天呈實驗儀器制有限公司；XP6電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；860型粉碎機，南京威利朗是食品機械有限公司；E100LED MV生物顯微鏡，日本尼康公司；BSD-150搖床培養箱，上海博訊實業有限公司；ATAGO（愛拓）糖度計，廈門森態儀器儀表有限公司；YX-280高壓滅菌鍋，江陰濱江醫療設備廠；CM-5色差計，科電貿易（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母種子擴培和啤酒發酵

在無菌條件下，用接種環從試管斜面上刮取1環酵母，接種于10 mL 12°P全麥芽麥汁種子培養液中，搖床培養24 h（25 ℃，180 r/min），之后轉入200 mL種子液（12°P全麥芽麥汁）中，搖床培養48 h（20℃，120 r/min），最后，轉入1 L種子液中，15℃靜置培養72 h。離心取酵母泥（8000 g，10 min，4 ℃）。接種量5× 106cells/mL/°P。

采用2 L錐形瓶進行啤酒發酵，裝無菌麥汁量為1.0 L。發酵溫度為15℃。每天定時取樣，發酵液和酵母菌體經離心分離（8000 g，15 min，4℃），將上清液置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 酵母細胞計數和活細胞率

采用血球計數板計數法測定懸浮酵母細胞數量和活細胞率（亞甲基藍染色）。將從錐形瓶中取出的樣液稀釋10倍后測定其懸浮細胞數和活細胞率。在0.1 mL細胞懸浮液中加入0.9 mL磷酸鹽亞甲基藍溶液（pH4.6），振蕩混勻，10 min后在電子顯微鏡下通過血球計數板對活細胞和死細胞（死亡的細胞被染成了藍色）進行計數。

1.2.3 麥汁濃度和酒精度測定

將發酵后的麥汁離心取上清液（8000 g，15 min，4℃）30 mL，倒入25 mL的附溫比重瓶中，將附溫比重瓶置于20℃水浴中，待溫度升到20℃，快速取出，稱其重量，測定其在20℃條件下的浸出物含量。麥汁濃度用“°P”表示，即100 mL麥汁中含有浸出物的固形物的量（g）。

將發酵后的麥汁離心取上清液50 mL，倒入500 mL蒸餾瓶中，再加入50 mL去離子水，加熱蒸餾。用50 mL的容量瓶收集餾出液，當餾出液體積接近50 mL時，停止蒸餾，用蒸餾水定容至50 mL。用附溫比重瓶測定其在20℃條件下的乙醇濃度。

1.2.4 麥汁FAN測定

麥汁的FAN水平測定采用茚三酮顯色法[16]。制備甘氨酸標準溶液（0、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、140μmol/L、160μmol/L），繪制標準曲線。麥汁樣品稀釋100倍，首先在具塞玻璃試管中加入2.0 mL的稀釋樣品，然后加入1.0 mL的顯色劑（0.5 g茚三酮、10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4和0.3 g果糖溶于100 mL去離子水，pH 6.7）；再將試管放進100℃沸水浴中，反應時間為16 min，然后20℃恒溫水浴下冷卻20 min，待冷卻完成后加入5.0 mL的稀釋劑（2.0 g KIO3溶于1 L的40%乙醇水溶液），用旋渦振蕩器混勻，靜置15 min；最后在波長570 nm條件下檢測樣品吸光值。計算公式如下：

1.2.5 麥汁游離氨基酸測定

首先要將樣品進行前處理：啤酒樣品超聲脫氣后，0.45 μm濾膜過濾。

衍生劑的配制：吸取1 mL AccQ·Fluor稀釋劑（2B瓶）放入裝有AccQ·Fluor衍生劑粉末的2A瓶中，加蓋密封，旋渦振蕩10 s；在加熱裝置上加熱2A瓶，直至AccQ·Fluor衍生劑粉末全部溶解，加熱時間不超過10 min，溫度不超過55℃。

氨基酸的衍生方法：取20 μL的18種標準氨基酸（AA）混合液放入6×50 mm樣品管中，再加入60 μL硼酸緩沖液（1瓶）到樣品管中，渦旋混合；待混合均勻，在上述樣品管中加入20 μL配制好的AccQ·Fluor衍生試劑，立即渦旋混合數秒鐘，放置1 min。然后將樣品管中的反應物轉移到一只微量樣品瓶中，加蓋密封，在55℃的加熱裝置中加熱10 min。

色譜條件：色譜柱為Waters公司的C18氨基酸專用分析色譜柱；柱溫：37℃；DAD檢測波長為248 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；流動相A：醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液；流動相B：乙腈；流動相C：超純水。外標法定量。

1.2.6 啤酒風味物質測定

在測定前將樣品放置在4℃條件下保存，主要是為了防止殘留酵母細胞的生長和揮發性風味物質的揮發。在氣質萃取瓶中加入12 mL樣品和3 g NaCl，接著用PTFE-silicone瓶蓋密封后進行HSSPME-GC-MS分析。色譜條件：采用60μm CARPDMS萃取頭，將裝有樣品的萃取瓶在45℃下平衡15 min，頂空萃取30 min。柱型采用DB-Wax毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25μm），載氣：氦氣，流速：1.0 mL/min，分流比：20∶1。升溫程序：40 ℃，保持2 min，然后以6℃/min的速度升溫至230℃，保溫3 min。進樣口溫度為230℃。質譜條件：離子源溫度為240℃，電離方式EI，電離電壓70 eV，質量掃描范圍m/z 40～450 u。化合物鑒定采用計算機譜庫（NIST2011譜庫）檢驗分析，進行定性，用內標正辛醇定量，所得風味物質為相對于內標的含量。

1.2.7 麥汁發酵度的計算

麥汁發酵度是啤酒發酵過程中麥汁固形物被酵母消耗的百分數。計算公式如下：

1.3 數據分析

每個數據均為3次測定的平均值，采用Minitab 16進行數據分析，SPSS 20進行相關性分析，結果以均值±標準差表示，多重比較采用Tukey法，顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同麥汁濃度對酵母生長和活細胞率的影響

酵母細胞數反映的是酵母生長的狀況，酵母活細胞率則表示了環境中酵母新陳代謝的整體能力。由圖1A可知，不同氮源水平的麥汁中，懸浮酵母細胞數在發酵初期快速增加，高濃20°P和24°P在發酵第1天中，增加速度均低于其他濃度麥汁，這可能是高滲透壓導致酵母細胞生長在發酵初始階段產生一個短暫的延滯期。在發酵第2天懸浮細胞數最多，酵母凈生長量隨著麥汁濃度的增大而減小，這是因為高滲透壓抑制了酵母生長。在第2天后，因為酵母細胞的絮凝導致懸浮酵母細胞數逐漸下降。酵母絮凝性是啤酒酵母的一個重要特性，在生產過程中絮凝性的強弱不僅可控制啤酒的發酵周期、過濾性能等，而且會對啤酒的風味產生影響，這在生產上具有特殊意義，酵母絮凝性也是區別酵母菌株的一項重要指標[17-18]。主發酵溫度一定時，原麥汁濃度對酵母絮凝性影響較大，原麥汁濃度越高，酵母絮凝性越低[19]。發酵2 d后，16°P、20°P、24°P高濃麥汁中的懸浮酵母數總是多于8°P低濃和12°P常濃中的懸浮酵母數，這是由環境中豐富的氮源對細胞生長的促進作用所導致。可見，豐富的FAN增強了酵母細胞活性、促進了酵母后期的生長，從而緩解了高滲透壓對酵母細胞的脅迫作用[20]。

酵母活細胞率的變化如圖1B，同懸浮酵母細胞數變化規律相似，呈現了先上升后下降的趨勢。在發酵第2天活細胞率最大，且麥汁濃度增大，活細胞率顯著降低；在發酵第2天后，8°P和12°P麥汁中活細胞率均大于高濃麥汁；在發酵進入末期之前，所有試驗組的酵母活細胞率均保持在較高水平（≥95%），發酵后期有所降低；當麥汁濃度≤16°P時，發酵結束后活細胞率仍保持在90%以上，20°P和24°P麥汁中的活細胞率在發酵末期顯著下降，尤其是24°P麥汁，最后的活細胞率低于80%，這是因為累積的高乙醇對酵母細胞產生了毒害作用[21]。

圖1 發酵過程中懸浮酵母細胞個數（A）和活細胞率（B）的變化

2.2 不同濃度麥汁發酵過程中FAN的消耗情況

FAN含量的高低作為一個重要的指標，反映了酵母在生長繁殖、新陳代謝等過程中對環境中氮源的需求。有報道指出，FAN消耗主要集中在酵母細胞的生長對數期，而在穩定期和衰亡期消耗很低[22]。發酵過程中游離氨基氮水平的變化情況見圖2。由圖2可知，在不同濃度麥汁發酵過程中，FAN水平的變化趨勢一致，酵母對FAN的快速吸收主要集中在接種后的24 h內。在發酵2 d時，FAN水平逐漸升高，之后依次呈現降低、升高的波動趨勢，產生這種現象的原因是：營養物質缺乏時，酵母細胞在緩慢吸收氮源的同時也在代謝產氮，在發酵24 h前處于酵母細胞生長的對數期，大量的FAN被酵母細胞吸收用于自身的生長繁殖，在約24 h時進入穩定期，活細胞數最大，酵母細胞對FAN的消耗趨于平穩降低，酵母細胞代謝產物中的氮源與酵母吸收利用的可同化氮源幾乎相等，使環境中的FAN水平趨于不變，此時的FAN水平最低，在24 h后，隨著發酵的繼續進行，環境中可利用的氮源缺乏及酵母生長進入穩定期和衰亡期，使酵母細胞代謝釋放到環境中的氮源水平高于吸收的氮源水平，故發酵環境中的FAN水平呈現上升趨勢。在發酵末期，8°P和12°P麥汁中的FAN水平不再有明顯的變化，而16°P、20°P、24°P高濃麥汁中FAN水平持續上升，是因為發酵后期乙醇的大量積累對酵母細胞產生了毒害作用，致使酵母細胞生理和結構形態發生變化，導致細胞內大量的氮源被釋放出來；并且麥汁濃度越高，FAN水平升高幅度越大，說明發酵末期乙醇累積量越大，對酵母細胞產生的毒害作用和細胞被損壞的程度也就越大，釋放到環境中的FAN就會越多。由圖2也可看出，高濃麥汁發酵不僅延長了發酵時間，而且也增加了FAN的消耗量（8°P麥汁中FAN的消耗量為386.84 mg/L，12°P的為507.74 mg/L，16°P的為599.28 mg/L，20°P的為638.78 mg/L，24°P的為623.11 mg/L）。

2.3 不同麥汁濃度對酵母發酵度的影響

圖2 發酵過程中游離氨基氮水平的變化

麥汁發酵度反映了酵母對糖的利用情況，麥汁發酵度越高,表明酵母對糖的利用越充分，則環境中殘留的糖就會越少。糖的不完全利用會導致腐敗微生物的生長從而增大了啤酒受污染的風險[23]。在本研究中，常濃12°P麥汁的發酵度最大，為86%（圖3），8°P麥汁的發酵度有所降低（84.29%），這可能是由于較低的氮源水平導致細胞生長速度緩慢，降低了細胞對糖的轉化率[23]。16 °P、20 °P、24 °P麥汁的發酵度分別為85.83%、82.5%和81.98%，在高濃條件下，麥汁濃度越高，發酵度越低，這可能是因為高滲透壓引起酵母活性發生改變、降低了發酵速率[24]，另一個原因是發酵后期的高乙醇濃度影響了酵母細胞活性、降低了細胞對糖的轉化速率[25]。然而12°P常濃麥汁與16°P高濃麥汁的發酵度之間沒有顯著性差異（P＞0.05），這是因為高的FAN水平改善了酵母細胞生長率和發酵度[14]，豐富的FAN調控酵母細胞適應了高滲透壓和其他環境脅迫，使得發酵初期高的糖濃度所形成的高滲透壓未能對酵母細胞產生很大的影響，從而未能明顯地抑制發酵。24°P超高濃麥汁和12°P常濃麥汁的發酵度之間存在顯著性差異（P＜0.05），這是發酵后期高乙醇濃度所致[26]。

圖3 不同麥汁濃度對發酵度的影響

2.4 不同麥汁濃度對乙醇產量的影響

乙醇產量是基于發酵過程中酵母所轉化的糖的總量（主要是葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖），它和發酵度、酵母細胞數、麥汁營養成分（主要是氮源和碳源）之間都是相互聯系的，發酵環境中豐富的營養成分促進酵母細胞生長，提高發酵度，高的糖含量和大量的酵母導致高的乙醇產量。酵母對乙醇的耐受性一定程度上依賴于菌種，啤酒酵母對乙醇的耐受性較低，通常情況下，乙醇濃度超過10%vol會嚴重抑制酵母菌的生長[27]。不同濃度麥汁中酵母的產乙醇量如圖4，隨著麥汁濃度增大，酵母的最終的乙醇產量依次增加，并且有顯著性差異（P＜0.05）。24°P超高濃麥汁中的酵母產乙醇量最大，為11.48%vol；16°P和20°P高濃麥汁中酵母的乙醇產量分別是7%vol和10.59%vol，均高于常濃麥汁（5.32%vol），而低濃麥汁中乙醇產量僅為3.1%vol，這是因為低濃麥汁中營養物質的缺乏影響了酵母的發酵，而常濃及高濃麥汁中豐富的營養組成滿足了酵母對糖的降解。

圖4 不同麥汁濃度下的乙醇產量

2.5 不同麥汁濃度對啤酒風味的影響

不同麥汁濃度對啤酒高級醇、酯產量的影響見表1。麥汁濃度從8°P升高至24°P，總高級醇的含量增加，總酯的含量減少。主要的高級醇有：異戊醇和苯乙醇，隨著麥汁濃度增大異戊醇的含量顯著增加，16 °P、20 °P、24 °P高濃麥汁中的異戊醇含量分別約為常濃麥汁（16 °P）的1.26、1.44、1.86倍，而苯乙醇的含量快速降低，但總高級醇的含量是呈增加趨勢，這是因為麥汁中α-氨基氮含量對啤酒發酵時高級醇生成量有明顯影響，α-氨基氮含量過高或過低都會使高級醇生成量增加[28]。說明高濃麥汁中豐富的氮源水平促進了啤酒高級醇的生成。此外，乙酸乙酯產量在24°P超高濃麥汁發酵中最大，為13.52 mg/L；隨著麥汁濃度的增大，辛酸乙酯、癸酸乙酯含量在減少，丁酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯在高濃發酵后麥汁中含量很少，甚至未檢測到，說明高滲透壓環境改變了酵母細胞對酯的代謝[29]。

表1 不同麥汁濃度發酵下啤酒的風味物質組成 (mg/L)

啤酒中高級醇和酯的比例是衡量啤酒感官的一個重要指標，優質啤酒的醇酯比一般在4～5∶1的水平[30]。本研究中隨著麥汁濃度增大，醇酯比呈升高趨勢，8 °P、12 °P、16 °P、20 °P、24 °P麥汁發酵結束后，高級醇酯比分別約為0.87∶1、1.62∶1、3.06∶1、4.06∶1、4.07∶1，可見，高濃麥汁發酵增加了啤酒的柔和性，使啤酒口感更加協調，這對生產是非常有利的。

2.6 不同濃度麥汁發酵過程中氨基酸的同化

發酵過程中麥汁游離氨基酸的濃度和種類是酵母細胞對其吸收和分泌的綜合結果。本研究分別在麥汁發酵開始和結束時對麥汁中的游離氨基酸組成和含量進行了測定，通過氨基酸同化量來確定不同麥汁濃度條件下酵母對氨基酸的吸收規律和適應高濃條件的關鍵氨基酸，見表2。結果發現，當麥汁濃度從8°P升高到20°P時，總的游離氨基酸同化量顯著增加（提高了60%），這說明在啤酒高濃釀造中酵母需要更多的額外可同化氮源適應環境脅迫[20]。然而，超高濃24°P的總氨基酸同化量最低，這是因為高滲透壓抑制了酵母的生長，影響了酵母對營養物質的消耗。此外，在不同的滲透壓條件下，Asp、Ser、Arg、Met、Lys和Trp的同化量都保持在較高水平，Phe和Trp的同化量隨麥汁濃度的增大逐漸升高，這與不同濃度麥汁改變了酵母對氨基酸的同化模式有關系。試驗中麥汁濃度的升高增加了發酵環境中總的游離氨基酸水平，但是，麥汁中氨基酸含量的升高并不一定能促進酵母對氨基酸的同化，這是氮代謝物阻遏效應的結果[31]。

表2 不同麥汁濃度發酵下酵母對游離氨基酸的同化 (mg/L)

2.7 高滲透壓環境脅迫下關鍵氨基酸的確定

根據不同濃度麥汁發酵過程中氨基酸的同化量與麥汁發酵度、乙醇產量和酵母活細胞率的相關性分析得到（表3）：在不同麥汁濃度條件下Ser、Met、Phe、Trp與酵母活細胞率呈顯著正相關性，His與發酵度呈顯著正相關，Phe與乙醇產量也呈顯著正相關，說明這幾種氨基酸對酵母適應高滲透壓環境脅迫作用有顯著的影響。

表3 游離氨基酸同化量與發酵性能各指標之間的相關性分析a

3 結論

隨著麥汁濃度升高，乙醇產量顯著增加，FAN的消耗升高，酵母生長減緩，發酵后期活細胞率降低，高級醇產量顯著增加，酯產量減少，有效增大了高級醇酯比，有利于改善啤酒風味，使得啤酒口感更加柔和、協調。此外，高濃麥汁產生的高滲透壓可導致酵母在生長初期出現短暫的延滯期，但豐富的氮源能很快消除高滲透壓的抑制作用，提高酵母的發酵性能。在不同麥汁濃度下，酵母對各氨基酸的同化量不盡相同，并經高滲透壓環境脅迫下酵母對游離氨基酸的同化量與發酵結束時麥汁的發酵度、乙醇產量、酵母活細胞率的相關性分析得到：Ser、Met、Phe、Trp、His的同化量與發酵性能呈顯著正相關性，說明這些氨基酸有助于酵母適應高滲透壓的環境脅迫。

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