利用ISSR分子標(biāo)記的特征條帶鑒別正毛化橘紅△

胡珊，楊志業(yè)，鄔龍怡，李華，計(jì)周正*

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮[1]，具有散寒、燥濕、消痰等功效，用于風(fēng)寒咳嗽，喉癢痰多[2]。化橘紅為廣東化州道地藥材，根據(jù)其果實(shí)表面絨毛的有無(wú)、多少分為大致正毛化橘紅、副毛化橘紅和光青化橘紅，品質(zhì)和功效以正毛化橘紅最優(yōu)[3-5]、副毛化橘紅次之、光青化橘紅最差，假西洋品種是外觀介于正毛和副毛之間、功效介于副毛和光果的一個(gè)較特殊品種，而正毛化橘紅和非正毛化橘紅的種苗在外觀形態(tài)非常相似，運(yùn)用傳統(tǒng)方法很難準(zhǔn)確區(qū)分。以生物分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，即DNA水平的分子標(biāo)記如RAPD、ISSR分標(biāo)記[6-7]等，相對(duì)于傳統(tǒng)形態(tài)標(biāo)記具有巨大優(yōu)勢(shì)，為解決品種混亂和品種優(yōu)劣問(wèn)題提供了一種新的手段。本文在ISSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上建立了一種利用PCR特征條帶組合來(lái)鑒別正毛化橘紅種苗的方法，該方法快速、簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確性高，只需要少量樣本即可實(shí)現(xiàn)正毛化橘紅種苗的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

研究實(shí)驗(yàn)：正毛化橘紅、副毛化橘紅、光青化橘紅等樣品均來(lái)自廣東省化州市和茂名市，并經(jīng)廣東省藥品檢驗(yàn)所楊志業(yè)副主任中藥師鑒定。其中正毛化橘紅樣品8份，副毛化橘紅5份，假西洋品種3份，光青化橘紅2份。采集其新鮮葉片并用硅膠快速干燥，采樣時(shí)間為2016年5月，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 研究實(shí)驗(yàn)樣品的來(lái)源及品種

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：2017年5月在廣州市香雪制藥股份有限公司的化州橘紅種植基地隨機(jī)選擇已掛果的部分正毛化橘紅、副毛化橘紅、假西洋品種和光青化橘紅共80棵，品種信息經(jīng)廣東省藥品檢驗(yàn)所楊志業(yè)副主任中藥師鑒定，其中正毛化橘紅24株，副毛化橘紅21株，假西洋品種23株，光青化橘紅12株。采集其葉片并做好其編號(hào)和品種信息記錄，具體情況見(jiàn)表樣品信息詳見(jiàn)表2。

1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、10×Taq緩沖液、dNTPs[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]；PCR擴(kuò)增引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 儀器

5418型高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；C1000 TouchTMwith 48/48 Fast Reaction型PCR擴(kuò)增儀(BioRad，美國(guó))；Gel DocTMXR+型凝膠成像系統(tǒng)(BioRad，美國(guó))

表2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)化橘紅樣品的品種情況

1.4 方法

1.4.1 DNA提取與檢測(cè) 采用天根植物基因組試劑盒提取所有樣品的基因組DNA。用微量紫外核酸儀檢測(cè)DNA濃度和純度。將合格樣品DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 ISSR分子標(biāo)記的引物篩選及PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.5 μL，引物(10 μmmol·L-1)0.5 μL，Taq DNA聚合酶1.5 U，DNA模板50 ng，用純水補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min；電泳條件：取10 μL PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混勻，于1×TAE、5 V·cm-1電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)照相存盤，每個(gè)處理重復(fù)2次。對(duì)50條ISSR引物進(jìn)行分析，篩選出條帶清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，并用篩選到的引物對(duì)SN1～SN18的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳，每個(gè)處理重復(fù)2次。

1.4.3 PCR擴(kuò)增的條件優(yōu)化 選用L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表3)，對(duì)Mg2+、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶、引物和DNA用量進(jìn)行5因素4水平的正交試驗(yàn)。以正毛化橘紅SN2樣本的DNA為模板，引物827作為擴(kuò)增引物，反應(yīng)總體積25 μL，含有10×PCR Buffer 2.5 μL，每個(gè)處理重復(fù)2次。

表3 PCR反應(yīng)正交體系濃度表

1.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以2017年5月采集的化橘紅(表2)葉片DNA為樣品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇最優(yōu)的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL 10×loading buffer用1.0%瓊脂糖凝膠，于1×TAE、5V·cm-1電泳30 min，凝膠成像儀下拍照。每個(gè)處理重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

將提取的所有樣品的基因組DNA在超微量紫外分光光度計(jì)下測(cè)量其濃度和純度，得到其A260/A280均在1.8～2.0之間，說(shuō)明DNA純度較高，符合PCR技術(shù)要求。

2.2 正毛化橘紅特征條帶分析及引物選擇

在50條ISSR隨機(jī)引物篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)引物818和827有不同于其他引物的特征條帶，其組合能夠鑒別正毛化橘紅。引物序列：818——CACACACACACACACAG，827——ACACACACACACACACG。

圖1和圖2分別為ISSR隨機(jī)引物818和827的電泳圖譜，第1～18泳道對(duì)應(yīng)的樣品分別為表1中SN1～SN18。圖1中第3～5、11、13、14、18泳道在200～500 bp之間接近500 bp處有一條條帶(白線圈出的條帶)，而其他泳道沒(méi)有，這7個(gè)泳道對(duì)應(yīng)的化橘紅樣品分別是SN3副毛、SN4假西洋、SN5光青、SN11假西洋、SN13副毛、SN14光青和SN18假西洋，其他泳道為正毛化橘紅和部分副毛化橘紅，說(shuō)明正毛化橘紅是沒(méi)有這一特征條帶的。圖2中第2、3、6～8、10、12、13、15、17泳道在200～500 bp之間接近500 bp處有明顯的條帶(白線圈出的條帶)，而其他泳道沒(méi)有，這10個(gè)泳道對(duì)應(yīng)的化橘紅樣品分別為SN2正毛、SN3副毛、SN6正毛、SN7正毛、SN8正毛、SN10正毛、SN12正毛、SN13副毛、SN15正毛、SN17正毛，說(shuō)明假西洋品種、光果、部分副毛化橘紅沒(méi)有這一特征條帶。綜合引物818和827的電泳圖譜可以看出，正毛化橘紅的標(biāo)記為(0，1)，即正毛化橘紅DNA用引物818擴(kuò)增沒(méi)有最下方的條帶，用827擴(kuò)增有最下方的條帶；副毛化橘紅的標(biāo)記為(0，0)或(1，1)，光果和假西洋品種的標(biāo)記為(1，0)。因此通過(guò)818和827這兩個(gè)引物的特征條帶能夠?qū)⒄偌t篩選出。

注：泳道1～18分別對(duì)應(yīng)表1中的樣品SN1～SN18。圖1 引物818的電泳圖譜

注：泳道1～18分別對(duì)應(yīng)表1中的樣品SN1～SN18。圖2 引物827的電泳圖譜

2.3 PCR體系優(yōu)化

使用正毛化橘紅SN2的DNA模板、引物827對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化的電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，本方法是采用特征條帶來(lái)鑒別正毛化橘紅，因此特征條帶明顯、雜帶少是關(guān)鍵。條件3、4、6、8、11、12、15、16這八個(gè)條件雜帶較多，而條件1和條件2因其DNA模板濃度太低可能存在潛在的不穩(wěn)定性，綜合各個(gè)條件的重復(fù)性和穩(wěn)定性，最終選擇條件14，即PCR反應(yīng)體系為10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.7 μL，引物(10 μmmol·L-1)0.5 μL，Taq DNA聚合酶2.0 U，DNA模板65 ng。用該條件對(duì)引物818進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其特征條帶也非常清晰，只是其他條帶稍多。為了使本研究建立的方法更加簡(jiǎn)便，對(duì)引物818和827采用同樣的PCR擴(kuò)增體系。

注：泳道1～16分別為表3中1～16組不同PCR反應(yīng)體系。圖3 正交體系優(yōu)化電泳圖譜

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖4-圖7分別為表2的化橘紅DNA模板采用引物818和827擴(kuò)增的電泳圖譜，Marker右側(cè)的泳道從左到右依次為表2的編號(hào)從小到大的順序。將所有樣品的818和827特征條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有特征條帶記為1，無(wú)特征條帶記為0，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，所有正毛化橘紅的標(biāo)記均為(0，1)，副毛化橘紅的標(biāo)記為(0，0)或(1，1)，光果和假西洋品種的標(biāo)記為(1，0)。由電泳圖譜可知，所有正毛化橘紅在200～500 bp之間均無(wú)818的特征條帶，均有827的特征條帶，說(shuō)明通過(guò)818和827這兩個(gè)引物的特征條帶能夠?qū)⒄偌t鑒別出。

注：泳道1～48分別對(duì)應(yīng)表2中的樣品1～48。圖4 化橘紅的引物818的電泳圖譜-1

注：泳道49～80分別對(duì)應(yīng)表2中的樣品49～80。圖5 化橘紅的引物818的電泳圖譜-2

注：泳道1～48分別對(duì)應(yīng)表2中的樣品1～48。圖6 化橘紅的引物827的電泳圖譜-1

注：泳道49～80分別對(duì)應(yīng)表2中的樣品49～80。圖7 化橘紅的引物827的電泳圖譜-2

3 討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)因其具有穩(wěn)定、多態(tài)性高、簡(jiǎn)便易操作及不受環(huán)境因素影響等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用到藥用植物種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析及道地性研究，并取得良好效果[8]。張春等[9]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)藥用當(dāng)歸及其混偽品進(jìn)行鑒別，找到了當(dāng)歸及其混偽品間的特異鑒別引物，為建立穩(wěn)定的當(dāng)歸質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供了技術(shù)支持。魏藝聰?shù)萚10]采用ISSR標(biāo)記分析草珊瑚的DNA指紋圖譜，結(jié)果證實(shí)ISSR分子標(biāo)記可以有效辨別18份受試草珊瑚樣品。ISSR分子標(biāo)記的后期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理一般采用聚類分析方法，得到聚類分析圖譜，但缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[8]，因此在生產(chǎn)推廣應(yīng)用上收到限制。本研究是在ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上找到正毛化橘紅的特征條帶組合，建立了通過(guò)2條引物鑒別正毛化橘紅的PCR方法，并且進(jìn)行了大量樣品的驗(yàn)證。該方法快速簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確，且無(wú)需通過(guò)聚類分析，直接根據(jù)特征條帶來(lái)鑒別正毛化橘紅，可以應(yīng)用于化橘紅種植基地的種苗篩選中，得到品質(zhì)最好的正毛化橘紅種苗，為優(yōu)質(zhì)化橘紅種苗的篩選提供技術(shù)支持。

表4 化橘紅的品種及特征條帶情況

由于ISSR標(biāo)記利用的是非特異引物，其擴(kuò)增條帶的穩(wěn)定性是相對(duì)的，因此在進(jìn)行PCR時(shí)需要嚴(yán)格保證各項(xiàng)條件一致才能得到較穩(wěn)定的電泳條帶，最理想的結(jié)果是將其轉(zhuǎn)化為采用特異引物對(duì)擴(kuò)增的SCAR分子標(biāo)記。在本研究中已經(jīng)找到正毛化橘紅的特征條帶組合(特征標(biāo)記)，下一步可考慮將ISSR標(biāo)記中的特異性條帶回收、克隆和測(cè)序，設(shè)計(jì)特異引物對(duì)，轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，以建立更加穩(wěn)定的分子鑒定方法。

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