利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測金絲桃苷治療動脈粥樣硬化的作用靶點及作用機制△

劉馳，袁宇，趙文婷，胡麗萍

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847)

中藥是一個高度復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)體系，其復(fù)雜性表現(xiàn)為化學(xué)成分的復(fù)雜，以及與人體相互作用關(guān)系的復(fù)雜。中藥研究者通過多途徑、多靶點、整體調(diào)節(jié)機制探索中藥的藥效作用。但迄今為止，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究尚無根本性突破，原因是缺乏對中藥高度復(fù)雜性及系統(tǒng)性進行研究的手段，如何揭示并系統(tǒng)闡明中藥化學(xué)物質(zhì)組成與藥效間的復(fù)雜關(guān)系，是中藥新藥研發(fā)的熱點和關(guān)鍵[1]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)快速發(fā)展的基礎(chǔ)上提出的藥物設(shè)計新方法和新策略，它基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)，通過分析基因網(wǎng)絡(luò)庫、蛋白網(wǎng)絡(luò)庫、疾病網(wǎng)絡(luò)庫、藥物網(wǎng)絡(luò)庫等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的信息資料，結(jié)合從實驗中獲得的譜圖數(shù)據(jù)，利用專業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，系統(tǒng)的、整體的揭示疾病-疾病、疾病表型-靶點蛋白、靶點蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯(lián)系[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中藥成分-靶點-疾病-機制的研究提供了新的方法。

山楂作為常用中藥材，臨床上應(yīng)用廣泛，其藥理作用主要包括調(diào)節(jié)血脂、助消化、保肝、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等[3]。有實驗證明，山楂的降血脂作用顯著，并對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)有治療作用[4-5]。然而山楂(果肉、核及葉)所含化學(xué)成分較多，目前為止從山楂中發(fā)現(xiàn)且分離得到的物質(zhì)有150多種，包括黃酮及其苷、有機酸、黃烷及其聚合物等[6]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，山楂黃酮是降血脂的主要成分，而金絲桃苷(Hyperin，Hyperoside，Hyp)是山楂黃酮的主要組分之一，可能對于治療高血脂癥，阻止血管動脈粥樣硬化的形成具有重要的意義[7]。

目前，對Hyp治療AS的作用靶點及其分子機制相關(guān)研究較少，需要進一步挖掘和整合，因此本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“成分-靶點-疾病-通路”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測Hyp治療AS的作用靶點及其作用機制，為后續(xù)實驗提供參考性依據(jù)。

1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)；GAD數(shù)據(jù)庫(https：//geneticassociationdb.nih.gov/)；DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)；Cytoscape-v3.2.1。

2 方法

2.1 Hyp相關(guān)靶點預(yù)測

TCMSP數(shù)據(jù)庫是西北農(nóng)林科技大學(xué)研究開發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，該數(shù)據(jù)庫包含499味草藥以及每味草藥的化合物成分，針對每個化合物提供了較全面的人體吸收、分布、代謝和排泄性質(zhì)評價數(shù)據(jù)，同時提供了潛在活性分子的靶點及疾病信息，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢Hyp作用靶點，檢索得到Hyp相關(guān)靶點蛋白名稱。全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫Uniprot是一個集中收錄蛋白質(zhì)資源并能與其他資源相互聯(lián)系的數(shù)據(jù)庫，也是收錄蛋白質(zhì)序列目錄最廣泛、功能注釋最全面的一個數(shù)據(jù)庫，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換成相對應(yīng)的基因名稱并去除非人源的靶點基因名稱，為后期PPI網(wǎng)絡(luò)的拓撲分析做準(zhǔn)備。

2.2 AS相關(guān)靶點預(yù)測

GAD數(shù)據(jù)庫由美國國立衛(wèi)生院開發(fā)和維護，數(shù)據(jù)庫的信息以基因為核心，支持在線查詢某種特定疾病相關(guān)的基因或某個基因相關(guān)的疾病信息。首先對整個GAD數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行下載，然后查詢AS作用靶點，剔除重復(fù)項后直接得到AS相關(guān)靶點基因名稱。

2.3 Hyp靶點蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將準(zhǔn)備好的Hyp作用靶點的基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，繪制Hyp作用靶點與靶點相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。具體操作步驟：1)打開Cytoscape-v3.2.1軟件中的Bisogenet插件，將Hyp作用靶點基因名稱導(dǎo)入Input Identifiers。2)參數(shù)設(shè)置。導(dǎo)入基因名后可見“Network building options”，“Network building options”下面包括4個按鈕，分別為“Identifiers”、“Data Settings”、“Method”和“Output”。首先，點擊“Identifiers”可見選項“Organism”和“Map Input identifiers list to”，在“Organism”中選擇“Homo sapiens(Human)”，在“Map Input identifiers list to”選擇“Gene identifiers only”。其次，點擊“Data Settings”可見“BioRelation Types”下面“Protein protein Interaction”選項，打開“Protein protein Interaction”后可在“Data Sources”選項下進行數(shù)據(jù)庫選擇，最終選擇“BIOGRID”數(shù)據(jù)庫。最后，“Method”和“Output”按鈕中內(nèi)容為默認選項，可以不做處理。3)點擊Submit進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2.4 AS靶點蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將準(zhǔn)備好的AS作用靶點的基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，繪制AS作用靶點與靶點相關(guān)的蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。具體操作步驟：1)打開Cytoscape-v3.2.1軟件中的Bisogenet插件，將AS作用靶點基因名稱導(dǎo)入Input Identifiers。2)參數(shù)設(shè)置。導(dǎo)入基因名后可見“Network building options”，“Network building options”下面包括4個按鈕，分別為“Identifiers”、“Data Settings”、“Method”和“Output”。首先，點擊“Identifiers”可見選項“Organism”和“Map Input identifiers list to”，在“Organism”中選擇“Homo sapiens(Human)”，在“Map Input identifiers list to”選擇“Gene identifiers only”。其次，點擊“Data Settings”可見“BioRelation Types”下面“Protein protein Interaction”選項，打開“Protein protein Interaction”后可在“Data Sources”選項下進行數(shù)據(jù)庫選擇，最終選擇“BIOGRID”數(shù)據(jù)庫。最后，“Method”和“Output”按鈕中內(nèi)容為默認選項，可以不做處理。3)點擊Submit進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的拓撲分析和核心靶點的篩選

首先，通過Hyp靶點相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)和AS靶點相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建交集網(wǎng)絡(luò)。其次，使用Cytoscape-v3.2.1軟件中CytoNCA插件對新建立的交集網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，操作步驟：1)選擇“Tool”后下拉菜單選擇“NetworkAnalyzer”，接著在“NetworkAnalyzer”的子菜單中選擇“Network Analysis”，然后在“Network Analysis”的子菜單中選擇“Analyze Network”。2)除Degree(DC)和Select All Centralities外，勾選其他選項進行分析。3)選擇“File”后下拉菜單選擇“exprot”，接著在“exprot”的子菜單中選擇“table”，在“table”的子菜單中選擇“Export Table”，然后在“Export Table”的子菜單中選擇“Merged Network defaul node”導(dǎo)出拓撲數(shù)據(jù)。4)根據(jù)導(dǎo)出的拓撲數(shù)據(jù)計算Degree的中位數(shù)。最后，用Degree值篩選核心靶點。篩選條件參數(shù)設(shè)置：①點擊“Select”按鈕選擇“+”，接著選擇“column fliter”下拉菜單中的“Node：Degree”可以進行Degree值范圍設(shè)置。②對Degree值范圍的界定，上限為拓撲數(shù)據(jù)中Degree的最大值，下限為Degree的中位數(shù)的兩倍。

2.6 對核心靶點進行GO注釋分析和KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)進行GO注釋分析和KEGG通路分析。設(shè)置參數(shù)，1)Upload：Step 1-輸入核心靶點基因名稱，Step 2-official genesymbol，Step 3-Gene List，Step 4-Submit List。2)List：Homo sapiens-Select Species。3)Background：Homo sapiens-use。參數(shù)設(shè)置完成后得到Gene_Ontology(GO注釋分析)和Pathways(KEGG通路分析)數(shù)據(jù)，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)結(jié)果進行進一步的篩選，篩選條件符合P<0.05和P<0.01。

3 結(jié)果

3.1 Hyp靶點信息及PPI網(wǎng)絡(luò)圖

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到Hyp靶點蛋白質(zhì)9個，剔除非人源靶點后最終得到8個靶點蛋白質(zhì)，將8個靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)化成8個靶點基因名稱，靶點相關(guān)信息見表1。將8個靶點基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，生成Hyp靶點蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示與Hyp相關(guān)的節(jié)點蛋白質(zhì)278個，邊緣蛋白質(zhì)2308個，Hyp的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

表1 金絲桃苷相關(guān)靶點信息

3.2 AS靶點信息及PPI網(wǎng)絡(luò)圖

通過GAD數(shù)據(jù)庫檢索得到AS靶點基因172個，靶點基因信息見圖2。將172個靶點基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，生成AS靶點蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示與AS相關(guān)節(jié)點蛋白質(zhì)1851個，邊緣蛋白質(zhì)25 980個，AS的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。

3.3 核心靶點信息

建立Hyp的PPI網(wǎng)絡(luò)和AS的PPI網(wǎng)絡(luò)的交集網(wǎng)絡(luò)后，可以得到93個節(jié)點蛋白質(zhì)和676個邊緣蛋白質(zhì)構(gòu)成的交集網(wǎng)絡(luò)圖，交集網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。對交集網(wǎng)絡(luò)圖的拓撲數(shù)據(jù)中Degree值進行排序，得到Degree最大值為57，計算所得Degree值中位數(shù)為13，將核心靶點篩選條件范圍設(shè)置為26～57，最終篩選結(jié)果得到10個核心靶點蛋白質(zhì)，具體核心靶點蛋白質(zhì)信息見圖5。

注：靶點；靶點相關(guān)節(jié)點蛋白質(zhì)。圖1 金絲桃苷PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 動脈粥樣硬化相關(guān)靶點信息

圖3 動脈粥樣硬化PPI網(wǎng)絡(luò)圖

注：表示Degree值由小到大。圖4 金絲桃苷PPI網(wǎng)絡(luò)和動脈粥樣硬化PPI網(wǎng)絡(luò)的交集網(wǎng)絡(luò)

圖5 核心靶點蛋白質(zhì)

3.4 核心靶點的GO注釋分析和KEGG通路分析結(jié)果可視化

通過DAVID數(shù)據(jù)庫分析，GO注釋分析結(jié)果顯示有9個基因有注釋數(shù)據(jù)，42個生物過程中有富集，設(shè)置篩選條件后，符合P<0.05的生物過程有29個，符合P<0.01的生物過程有12個，GO注釋分析信息見圖6。KEGG通路分析結(jié)果顯示有9個基因有注釋數(shù)據(jù)，17條通路有富集，設(shè)置篩選條件后，符合P<0.05的通路有7條，符合P<0.01的信號通路有4條，KEGG通路分析信息見圖7。在GO注釋分析和KEGG通路分析中都有富集的是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路。

圖6 金絲桃苷治療動脈粥樣硬化的GO注釋分析

圖7 金絲桃苷治療動脈粥樣硬化的KEGG通路分析

4 討論

動脈粥樣硬化是導(dǎo)致冠心病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。早在18世紀(jì)中葉病理學(xué)家發(fā)現(xiàn)50%～70%的急性心肌梗死患者冠狀動脈固定狹窄<50%。1910年Osler認為，冠狀動脈粥樣硬化時，任何用力均可引起心肌缺血。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制一直是研究熱點，目前認為可能是多種發(fā)病機制共同作用的結(jié)果，涉及復(fù)雜和龐大的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，包括血管損傷、炎癥、凋亡、細胞增殖和氧化應(yīng)激等[8]。

我們前期實驗證明山楂總黃酮在降血脂和心肌缺血保護方面發(fā)揮重要的作用。金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D吡喃半乳糖苷，是山楂中的主要化學(xué)成分之一，屬于黃酮醇類化合物，目前最突出的藥理活性是抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡、抗血栓和抗炎[9-10]。因此探索金絲桃苷對于動脈粥樣硬化的干預(yù)作用具有重要意義。

為了找到Hyp作用于AS的關(guān)鍵分子或調(diào)節(jié)結(jié)點，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法首先預(yù)測AS作用靶點蛋白質(zhì)172個和Hyp作用靶點蛋白質(zhì)8個，然后構(gòu)建AS靶點蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)和Hyp靶點蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)，取兩個蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)的交集，得到交集節(jié)點蛋白質(zhì)93個，最后經(jīng)過篩選得到10個核心靶點蛋白質(zhì)，分別為EGFR、GRB2、NTRK1、HSP90AA1、HSP90AB1、FBO6、PSMA3、PTPN1、HUWE1和VCP。通過靶點蛋白進行GO注釋分析和KEGG通路分析，分析結(jié)果顯示PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路在GO注釋分析和KEGG通路中都有富集，因此，Hyp治療AS可能是通過PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路而發(fā)揮作用。

表皮生長因子受體(Human epidermal growth factor receptor，HER/erbB)家族是酪氨酸激酶受體(RTKs)，他們包括4種同源的跨膜蛋白：HER1(EGFR或erbB1)、HER2(neu或erbB2)、HER3(erbB3)和HER4(erbB4)[11]。表皮生長因子受體信號通路啟動首先是受體和配體形成二聚體，其中EGFR與HER2形成的異二聚體最常見，然后C-末端酪氨酸的磷酸化為具有SH2結(jié)構(gòu)域或者PTB結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)信號分子提供結(jié)合位點，這些信號分子包括：銜接蛋白(如GRB2)和激酶(如PI3K)，進行信號傳遞。啟動含有SH2結(jié)構(gòu)域的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子來激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)(含有銜接蛋白GRB2)和PI3K信號通路(含有激酶PI3K)[12]。因此，EGFR和GRB2兩個核心靶點蛋白質(zhì)可能在PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路中起到關(guān)鍵的作用。

PI3K屬于磷脂激酶家族，主要通過兩種方式激活：一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體(如EGFR)等或者銜接蛋白相互作用，引起聚二體構(gòu)象改變而被激活；另一種是通過Ras和催化亞基直接結(jié)合導(dǎo)致PI3K活化，活化的PI3K進一步催化胞質(zhì)膜上PIP3的生成，PIP3與含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白AKT結(jié)合而活化AKT[13-14]。PI3K/AKT信號通路在細胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用。

MAPK信號主要特點是具有MAPK級聯(lián)反應(yīng)，MAPK至少有12種，分屬于ERK家族、p38家族和JNK家族，在不同的細胞中，MAPK通路成員組成及誘導(dǎo)的細胞應(yīng)答有所不同。ERK在生長因子介導(dǎo)的細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。Ras屬于ERK家族，Ras/MAPK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)表皮生長因子(EGF)信號，其基本過程是EGF與HER2形成異二聚體，激活受體的蛋白激酶活性，受體自身酪氨酸殘基磷酸化形成SH2結(jié)合位點，從而結(jié)合含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白GRB2，進一步活化SOS分子，活化的SOS結(jié)合Ras蛋白，促進Ras釋放GDP、結(jié)合GTP，活化的Ras蛋白(Ras-GTP)可以激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)，通過磷酸化作用激活多種效應(yīng)蛋白，從而發(fā)揮作用[15-16]。MAPK信號通路與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡密切相關(guān)。

綜上所述，Hyp治療AS的機制可能是通過EGFR和GRB2兩個核心靶點蛋白質(zhì)調(diào)控PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路，參與AS相關(guān)因子、蛋白和受體等重要調(diào)控分子的活化而影響AS的病理進程。

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