金銀花中烯啶蟲胺測定方法的研究△

侯少巖，李嘉欣，薛健*，王鵬思，武曉麗，袁亞莉

(1.南華大學 化學化工學院，湖南 衡陽 421000；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

金銀花Lonicera Japonicae Flos.自古被譽為清熱解毒的良藥，其性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達又可祛邪[1]。種植過程中常伴有多種病蟲害，尤以蚜蟲最為嚴重[2]。經調研發現，煙堿類農藥對蚜蟲有優良的殺滅作用，其中烯啶蟲胺(Nitenpyram)為常用除蟲劑[3]，金銀花生產中也有使用。研究表明，新煙堿類殺蟲劑對傳粉昆蟲具有嚴重危害，威脅蜜蜂的種群，造成依靠蜜蜂傳粉的作物產量降低，歐盟現已經禁用包括吡蟲啉在內的3種新煙堿類殺蟲劑[4]。烯啶蟲胺在金銀花上的使用，可能在藥材上殘留，對環境及人體健康造成危害[5]。為準確評估其殘留風險，需要對藥材殘留情況進行測定。目前雖然已有文獻報道烯啶蟲胺的測定方法[6-8]，但未發現在金銀花中建立測定方法的相關報道，本實驗研究金銀花中烯啶蟲胺殘留量的測定方法。

1 材料

1.1 供試藥材

本實驗所用樣品由田間獲得，經中國醫學科學院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾，即金銀花。

1.2 試劑

乙腈、丙酮、甲醇(分析純，北京化工廠)；丙酮(色譜純，美國Mreda公司)；烯啶蟲胺標準品(100 μg·mL-1，農業部環境保護科研監測所，批號：20170428)；中性氧化鋁(200～300目，國藥集團化學試劑有限公司，550 ℃中活化5 h，貯存于干燥器中，過夜冷卻。活化后的中性氧化鋁中小心加入5%蒸餾水，充分搖勻，放置過夜)；弗羅里硅土(60～100目，天津市光復精細化工研究所，650 ℃中活化5 h，貯存于干燥器中，過夜冷卻。活化后的弗羅里硅土中小心加入5%蒸餾水，充分搖勻，放置過夜)。

1.3 儀器

Agilent 6890N氣相色譜儀，電子捕獲檢測器，美國安捷倫公司；SB-2500DT超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；LABOROTA4000/4旋轉蒸發器，德國Heidolph公司；TDZ5-WS低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

2 方法

2.1 氣相色譜條件

安捷倫DB-1701石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；電子捕獲檢測器；載氣為高純氮氣(>99.999%)；進樣口溫度260 ℃，不分流進樣；檢測器溫度320 ℃；升溫程序：初始溫度110 ℃，保持1 min，以20 ℃·min-1的速度升溫至240 ℃，保持15 min；恒流模式，流速1 mL·min-1；進樣量：1 μL；外標法定量。在該色譜條件下，烯啶蟲胺典型色譜圖如圖1A所示，保留時間為7.68 min。

2.2 標準品溶液的配制

取烯啶蟲胺標準溶液(100 μg·mL-1)1 mL于10 mL茶色容量瓶中，加色譜丙酮至刻度，得到10 μg·mL-1溶液作為母液保存于-20 ℃冰箱。取該母液1 mL，稀釋10倍得到1 μg·mL-1對照品溶液。

2.3 樣品提取及凈化方法研究

2.3.1 樣品的提取 本實驗采用簡單、經典的超聲提取法對樣品進行提取。對烯啶蟲胺溶解度較好的溶劑有丙酮和乙腈，對這兩種溶劑進行考察，通過比較提取率和對金銀花基質的提取情況擇優選擇溶劑。

選擇丙酮、乙腈分別對樣品進行提取。精密稱取金銀花粉末樣品2.0 g(過《中華人民共和國藥典》2號篩)于50 mL具塞離心管中，加入提取溶劑30 mL超聲提取15 min，靜置，過濾。樣品殘渣再加入提取溶劑20 mL超聲提取15 min，重復2次，靜置，過濾。合并所有濾液。40～45 ℃水浴旋蒸濃縮至近干，待凈化。

2.3.2 樣品的凈化 樣品提取后在烯啶蟲胺出峰位置存在干擾峰，為了將農藥與樣品的雜質分離，降低樣品對儀器的損害，需要對樣品進行凈化。與其他方法相比，固相萃取操作簡便、選擇性高，故采用固相萃取法。固相萃取凈化柱有商品柱和自組裝柱，相同填料時自組裝柱成本較低。金銀花基質復雜，且含有較多葉綠素，中性氧化鋁和弗羅里硅土對色素等復雜基質有較好的吸附，故通過比較中性氧化鋁與弗羅里硅土的凈化效果，擇優選擇。

分別填裝中性氧化鋁、弗羅里硅土作為凈化填料。玻璃柱(12 mm×250 mm)中依次加入2 g無水硫酸鈉、5 g填料、2 g無水硫酸鈉。輕敲玻璃柱身使其裝填盡量均勻、緊密，保持表面水平，用20 mL甲醇預淋玻璃柱內的填料，棄去流出液。待凈化樣品用少量甲醇轉移至凈化柱內，用25 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于圓底燒瓶內，于40～45 ℃減壓濃縮至近干，冷卻后用色譜丙酮定容至2 mL，4000 r·min-1離心5 min，取上清液注入氣相色譜儀，檢測。

3 結果與分析

3.1 提取溶劑的選擇

由表1可知，丙酮、乙腈對0.5 mg·kg-1添加的金銀花樣品中烯啶蟲胺的提取率分別為86.90%、95.40%；根據圖1中丙酮和乙腈對金銀花基質的提取效果可知，乙腈提取的金銀花基質色譜圖中的雜峰明顯少于丙酮，故選擇乙腈作為本實驗的提取溶劑。

注：1.烯啶蟲胺；A.烯啶蟲胺標準品溶液；B.丙酮提取空白樣品溶液；C.乙腈提取空白樣品溶液。圖1 不同溶劑提取空白金銀花基質溶液的GC圖

表1 不同溶劑對金銀花中烯啶蟲胺的提取率

3.2 凈化方法的選擇

凈化效果如圖2所示，D和B相比，經中性氧化鋁凈化后，烯啶蟲胺出峰位置干擾峰消失，基線明顯降低； D與C對比，雜質峰較低，基線也更低，即中性氧化鋁填充柱的凈化效果更佳。

注：1.烯啶蟲胺；A.烯啶蟲胺標準溶液；B.未凈化空白樣品溶液；C.經弗羅里硅土凈化后的空白樣品溶液；D.經中性氧化鋁凈化后的空白樣品溶液。圖2 不同填料對金銀花基質凈化效果比較

3.3 金銀花中烯啶蟲胺測定的方法學考察

3.3.1 線性范圍 將母液稀釋成質量濃度分別為5、10、20、100、200、500 μg·L-1系列的對照品溶液，分別進樣1 μL，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，線性擬合，得回歸方程為Y= 35.729X+239.98，相關系數r=0.999 3。說明在5～500 μg·L-1烯啶蟲胺濃度與峰面積線性關系良好。

3.3.2 儀器的精密度 取0.2 mg·L-1標準溶液重復進樣6次，連續3 d進行GC-ECD測定，得到烯啶蟲胺含量的精密度。結果顯示，日內精密度以RSD計為1.08%，日間精密度為2.76%，符合測定要求。

3.3.3 方法的檢出限與定量限 測定添加回收樣品溶液譜圖烯啶蟲胺色譜峰的信噪比，以信噪比(S/N)3為方法的檢出限，以信噪比(S/N)10為方法的定量限。結果顯示，方法對烯啶蟲胺的檢出限(LOD)為0.006 mg·kg-1，定量限(LOQ)為0.02 mg·kg-1。

3.3.4 方法的準確度和精密度 精密稱取空白樣品2.0 g，分別精密添加烯啶蟲胺標準品溶液得到0.02、0.1、0.2 mg·kg-1烯啶蟲胺添加樣品，按照所建立的方法進行提取、凈化，分別重復3次，測得峰面積并計算含量，得到各添加濃度回收率及精密度(見表2)。3個添加濃度的回收率在79.14%～98.37%之間，精密度(以RSD計)在3.66%～4.39%之間，符合農殘規定(回收率在70%～110%，RSD<15%)[11]及本實驗要求。

表2 金銀花中烯啶蟲胺添加回收率及精密度(n=3)

3.4 樣品測定

為驗證所建立方法的適用性，按照本實驗確定的方法對收集的施藥后的金銀花樣品進行測定，結果見表3。

表3 金銀花樣品中烯啶蟲胺殘留量

注：ND指殘留量低于檢出限。

4 討論

目前未有金銀花中烯啶蟲胺的最大殘留限量標準，我國國家標準GB 2763-2016 食品中農藥最大殘留限量[12]中要求在糙米中最大殘留限量(MRL)為0.1 mg·kg-1，稻谷中的MRL為0.5 mg·kg-1，蔬菜的MRL為0.2 mg·kg-1。若以最嚴格的糙米中的最大殘留限量0.1 mg·kg-1為參考標準，本方法的檢出限遠低于食品安全國家標準對烯啶蟲胺的限量標準。

本研究建立了GC-ECD測定金銀花中烯啶蟲胺殘留量的分析方法，靈敏度較高，準確度和精密度均能達到分析要求。此外，本方法還具有操作簡便、成本低、線性好的特點，同時，運用該方法對施用烯啶蟲胺的金銀花樣品進行測定，驗證了檢測方法的適用性。

[1] 韓君.清熱解毒金銀花[J].長壽，2016(4)：9.

[2] 王玉潔，薛健，顧炎，等.溴氰菊酯殘留測定方法及其在金銀花中殘留動態研究[J].中國中藥雜志，2016，41(8)：1435-1438.

[3] 田桂琴，黃永紅.11%阿維·烯啶蟲胺乳油防治棉葉螨和蚜蟲實驗[J].農村科技，2012(1)：29-30.

[4] 袁曉龍.新煙堿類殺蟲劑會降低熊蜂的傳粉效率[J].中國蜂業，2016，67(3)：63-63.

[5] 王廣馳.烯啶蟲胺和啶蟲脒對蚯蚓的氧化脅迫及基因毒性[D].泰安：山東農業大學，2015.

[6] 趙方方，林靖凌，謝德芳，等.氣相色譜法測定農田土壤和水中烯啶蟲胺殘留[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2014，42(10)：57-62.

[7] 劉飛，陳永煊.超高效液相色譜-串聯質譜法測定黃瓜中烯啶蟲胺殘留[J].福建輕紡，2011(11)：40-42.

[8] 黃勇平，潘曉威，HUANG Yong-ping，等.氣相色譜法測定豇豆和土壤中烯啶蟲胺的殘留[J].現代農業科技，2015(16)：125-126.

[9] 楊金川，胡德禹，張鈺萍，等.烯啶蟲胺在水稻和稻田環境中的殘留及消解動態[J].農藥學學報，2012，14(5)：521-526.

[10] 張貴群，聶思橋，龍麗萍，等.氣相色譜法分析甘藍及其土壤中的烯啶蟲胺殘留[J].色譜，2010，28(11)：1103-1106.

[11] 中華人民共和國農業部.NY/T 788-2004 農藥殘留試驗準則[S].北京：中國農業出版社，2004.

[12] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，中華人民共和國農業部，國家食品藥品監督管理總局.GB 2763-2016食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量[S].北京：中國標準出版社，2016.