TapMan熒光定量RT-PCR快速檢測乙型流感病毒核酸方法的建立及意義

高潔 嚴敏 付婷 邵中軍

流感作為常見病, 有季節性流行的特點, 病原菌種類較多, 不同病毒有不同檢測手段［1］。明確何種病毒所致, 對于進一步治療有很大幫助, 乙型流感病毒作為僅在人之間傳播的一種疾病, 與甲型流感病毒患病表現十分相似［2-4］。根據乙型流感病毒的核酸特點, 進行TapMan熒光定量RT-PCR快速檢測現采用較多, 為了探究其效果, 選取不同病毒和送檢樣本進行實驗, 現將結果整理如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2017年1～4月送至本實驗室檢驗的確診感染乙型流感病毒的咽拭子24例(均經血清學檢測, 確診為乙型流感病毒), 由北京生物制品研究所提供的甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒,以及用于效價滴定的MDCK細胞。

1.2 試劑 由北京奧科生物技術有限責任公司提供, 引物為乙型流感病毒核酸基因NP的一段保守序列, 只含有一級結構, 堿基數量在20個以內, 各引物不互補；探針5’端識別 FAM, 3’端識別 TAMRA［5］。

1.3 方法 ①選擇MDCK細胞將乙型流感病毒進行效價滴定, 分別制成不同濃度的制劑(10.00、1.00、0.10、0.01 TCID50/管), 待實驗使用。②選擇RT-PCR試劑盒(由NEB公司生產), 進行逆轉錄和擴增, 35次循環后取產物, 觀察特異性條帶的存在情況。③提取甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒的核酸, 進行TapMan熒光定量RT-PCR檢測。④對不同濃度的乙型流感病毒制劑分別進行常規RT-PCR和TapMan熒光定量RTPCR檢測。⑤采用常規RT-PCR和TapMan熒光定量RTPCR檢測送檢的咽拭子樣本, 并與血清學檢查結果對比。

1.4 觀察指標 ①記錄TapMan熒光定量PT-PCR對于不同病毒檢測的特異性。②記錄常規RT-PCR和TapMan熒光定量RT-PCR檢測對于不同濃度的乙型流感病毒的敏感性。③記錄對比常規RT-PCR和TapMan熒光定量RT-PCR檢測咽拭子樣本結果的準確性。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TapMan熒光定量RT-PCR檢測特異性 對于檢測甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒, TapMan熒光定量RT-PCR僅對乙型流感病毒呈陽性, 且反應與其他病毒無交叉。

2.2 TapMan熒光定量RT-PCR及常規RT-PCR檢測敏感度TapMan熒光定量RT-PCR相比于常規RT-PCR檢測, 對于不同濃度的乙型流感病毒敏感度更高。見表1。

表1 TapMan熒光定量RT-PCR及常規RT-PCR檢測乙型流感病毒敏感度

2.3 TapMan熒光定量RT-PCR及常規RT-PCR檢測準確率對24例送檢樣本, TapMan熒光定量RT-PCR的準確率為83.33%(20/24), 明顯高于常規RT-PCR檢測的54.17%(13/24),差異具有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

流感病毒作為流感發生的致病體, 其有多種不同類型。甲型流感病毒是最多見的一類, 乙型流感病毒與其結構相似,臨床表現接近, 但乙型流感病毒大爆發少見, 因此易誤診［6］。流感病毒的檢測有多種方法, 血清學檢測需要等到體內病毒水平蓄積到一定程度才可發現。常規RT-PCR檢測是根據一段乙型流感病毒的一段, 進行逆轉錄和擴增, 從而獲取特異性片段, 以此來判斷是否感染此種病毒［7］。這種方法一經發現, 并得到廣泛應用, 因為其相對傳統方法, 其特異性、敏感度以及耗時均有明顯提高。但廣泛使用中發現常規RTPCR檢測發生假陽性的問題較常出現, 這主要與擴增過程中其他病毒的污染有關［8］。由于甲型流感病毒與乙型流感病毒的結構相似, 也容易導致在檢測中出現假陽性。而病毒包括包膜、基質蛋白和核心, 不同類型的病毒的主要區別在于核心的差異。病毒的遺傳物質與核蛋白共同構成核糖核蛋白體,而TapMan熒光定量RT-PCR就是根據乙型流感病毒核酸的特異序列作為引物, 并以5’端識別FAM, 3’端識別TAMRA作為探針, 從而避免了出現其他病毒如甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒檢測陽性, 即交叉反應的出現。同時TapMan熒光定量RT-PCR檢測, 均在完全密閉的試管內進行, 因此其發生擴增中受污染的可能性大大降低, 從而降低發生假陽性的可能［9,10］。以上這些原因, 使得TapMan熒光定量RT-PCR相比于以前的常規RT-PCR有更好的特異性、敏感性以及準確率。同時這種方法進一步縮短了檢測乙型流感病毒的用時, 并且整個檢測過程也更加環保,不會產生對環境有害的物質。

此次研究中, 熒光定量RT-PCR對乙型流感病毒核酸有較強的特異性, 反應與其他病毒之間［甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒］不存在交叉, 同時在乙型流感病毒濃度為0.01 TCID50/管的病毒效價仍有較高的敏感性。這體現出其檢測特異性和敏感度的優勢。對送檢樣本,TapMan熒光定量RT-PCR相比于常規RT-PCR檢測的準確率更高 (P＜0.05)。

綜上所述, TapMan熒光定量RT-PCR是快速檢測乙型流感病毒核酸的方法, 其特異性、敏感度高, 不受其他病毒的干擾, 在咽拭子送檢樣本檢測的準確率上, 相比其他方法也有優勢, 建議臨床進行使用。

［1］ 方巧云, 琚雄飛, 曾健君.熒光定量PCR檢測急性呼吸道感染患者常見呼吸道病毒的研究.中國預防醫學雜志, 2013,14(5):201-202.

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［3］ 張弘, 何永強, 張嚴峻, 等.單管多重熒光定量RT-PCR方法鑒別新甲型H1N1及甲型和乙型流行性感冒病毒.中華預防醫學雜志, 2012, 46(3):273-276.

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［5］ 李文悌, 孫菲, 王曉春.SYBR GreenⅠ實時PCR檢測甲型H1N1與季節性流感病毒方法的建立.中國人獸共患病學報,2013, 29(1):59-63.

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［7］ 劉建榮, 宋淑娥, 何瑩, 等.實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應用// 公共衛生北京論壇——甲型H1N1流感防控高層研討會, 2009:1000-1002.

［8］ 李忠, 劉倜, 張圣洋.濟南地區兒童急性呼吸道感染病原譜分析.中國公共衛生, 2014, 30(4):520-523.

［9］ 王宇飛.G9型豬輪狀病毒TaqMan熒光定量RT--PCR檢測方法的建立及初步應用.東北農業大學, 2016.

［10］ 盧亦愚, 嚴菊英, 馮燕, 等.熒光定量RT-PCR快速檢測乙型流感病毒核酸.浙江預防醫學, 2005, 17(3):1-3.