響應(yīng)面法優(yōu)化夏至草總黃酮的提取工藝△

段建榮

(張家口市沙嶺子醫(yī)院 藥劑科，河北 張家口 07500)

夏至草為唇形科夏至草屬植物夏至草的全草，又名小益母草、白花益母草、白花夏枯草等，廣泛分布于華北、東北、西南、西北等地區(qū)。《本草綱目》中記載的茺蔚白花者應(yīng)是夏至草，可活血去瘀、調(diào)經(jīng)、降氣逆、平肝潛陽，用于月經(jīng)不調(diào)、半身不遂、血滯經(jīng)閉、貧血性頭昏等疾病。現(xiàn)代研究表明，夏至草醇提物能明顯減輕Dextran 500所致AMD大鼠腸系膜血液及淋巴微循環(huán)障礙[1]；能明顯降低dextran 500致AMD大鼠的血小板聚集與粘附功能、減少血栓形成[2]；能通過降低NO的生成和釋放，減輕大鼠重癥失血性休克后器官損傷[3]；可改善血瘀大鼠的血液流變性異常，提高器官血液灌流，具有良好的活血化瘀作用[4]；能明顯降低Dextran 500致AMD大鼠的全血粘度和血漿粘度，提高紅細(xì)胞變形能力[5]；能明顯減輕Dextran 500致急性微循環(huán)障礙大鼠各器官功能障礙與組織學(xué)損傷[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道夏至草中含有多種黃酮類物質(zhì)[7]，但未見有對夏至草總黃酮含量測定的研究。本文采用響應(yīng)面法對夏至草總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究開發(fā)夏至草提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

夏至草采自河北省張家口市萬全區(qū)，由張家口學(xué)院韓博副教授鑒定為夏至草Lagopsissupina正品；蘆丁對照品(北京盛世康普化工技術(shù)研究院FWYP-153-18-4)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器

T6紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Sartorius萬分之一精密電子天平(德國賽多利斯天平公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏至草總黃酮的提取

將干燥的夏至草粉碎后過20目篩，60 ℃干燥至恒重。精密稱取夏至草粉末10 g，選用不同濃度的乙醇溶液為提取溶劑，在單因素分析的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，選用不同濃度的乙醇溶液為提取溶劑，選取以乙醇濃度、料液比、提取溫度為考察因素，超聲輔助提取10 min，過濾，定容至100 mL。在提取工藝研究中改變相應(yīng)參數(shù)。

2.2 檢測波長的確定

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，用60%的乙醇溶液溶解并定容至50 mL的棕色容量瓶中，配成0.1 mg·mL-1的對照品溶液。吸取對照品溶液適量，按照2.3項(xiàng)下方法顯色，并于400～700 nm進(jìn)行掃描，測定吸光度，結(jié)果顯示，對照品溶液在510 nm處均有最大吸收，確定檢測波長為510 nm。掃描圖見圖1。

圖1 蘆丁溶液吸收光譜

2.3 夏至草總黃酮的含量測定

精密吸取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL的蘆丁對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，分別加60%的乙醇溶液適量至3 mL，各加入濃度為5%的亞硝酸鈉水溶液1 mL，搖勻，靜置6 min。分別加入10%的硝酸鋁水溶液0.3 mL搖勻，靜置6 min。分別加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，最后用30%的乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置14 min，于510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-10]。得到線性方程Y=0.917 1X-0.004 6(r=0.999 4)。表明在濃度為0.05～0.3 mg·mL-1范圍內(nèi)濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得Box-Behnken設(shè)計(jì)方案中各供試液中總黃酮濃度，按下式計(jì)算總黃酮得率。

總黃酮得率=供試液濃度(mg·mL-1)×稀釋倍數(shù)×體積(mL)/稱取樣品干質(zhì)量(g)×1000

(1)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取夏至草總黃酮提取液適量，按照2.3項(xiàng)下方法顯色，并于0、15、30、45、60 min測定吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果RSD=4.15%，表明樣品在室溫下60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取蘆丁對照品溶液1 mL，按照2.3項(xiàng)下方法顯色，連續(xù)測量6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果吸光度的RSD為1.22%，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法儀器精密度良好。

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，每份10 g，以優(yōu)化的條件提取，按照2.3項(xiàng)下方法顯色并測定吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果RSD為3.31%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.4加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知濃度的供試品溶液1 mL共5份，分別加入1mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法顯色并測定吸光度，計(jì)算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果平均回收率為82.6%，RSD=5.11%，表明方法的加樣回收率符合要求。

2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以黃酮提取率為考察指標(biāo)，按照上述總黃酮提取工藝，固定其他條件，分別考察不同乙醇濃度、液料比、提取溫度對夏至草總黃酮提取率的影響。

由圖2(A)可知，隨著乙醇濃度的增加，夏至草總黃酮的提取率不斷增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加乙醇濃度，總黃酮提取率明顯下降，因此乙醇濃度選擇在50%～70%進(jìn)行優(yōu)化。

由圖2(B)可知，隨著液料比的增大，夏至草總黃酮的提取率增加，但當(dāng)液料比超過40∶1后，總黃酮提取率變化不明顯，為節(jié)約溶劑，因此液料比選擇在30∶1～40∶1進(jìn)行優(yōu)化。

由圖2(C)可知，隨著提取溫度的提高，夏至草總黃酮的提取率不斷增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到65 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，繼續(xù)提高溫度，總黃酮提取率略有下降，因此提取溫度選擇在60～70℃進(jìn)行優(yōu)化。

注：A.乙醇濃度對提取率的影響；B.液料比對提取率的影響；C.提取溫度對提取率的影響。圖2 夏至草總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案[11-13]，以乙醇濃度A、液料比B、提取溫度C為考察因素，以夏至草總黃酮提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert v8.0.6軟件優(yōu)化夏至草總黃酮提取工藝。試驗(yàn)因素、水平編碼見表1。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析見表3。對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得夏至草總黃酮提取率對自變量乙醇濃度A、液料比B、提取溫度C的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=-23.77+0.17A-0.29B+0.78C+1.5×10-4AC-1.495×10-3A2+4.32×10-3B2-6.08×10-3C2

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

注：實(shí)驗(yàn)1～12為析因?qū)嶒?yàn)，13～17為中心實(shí)驗(yàn)。

由表3可知，P模型<0.01，說明模型高度顯著；模型的相關(guān)系數(shù)r=0.969 8，校正決定系數(shù)RAdj2=0.894 3，二者相近，說明模型實(shí)際值與預(yù)測值擬合較好；模型失擬項(xiàng)是表示模型理論值與實(shí)際值不相擬合的概率，P失擬=0.673 9>0.05，模型的失擬度不顯著，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程代表性較好，能準(zhǔn)確預(yù)測實(shí)際情況，使用該方程代替真實(shí)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析是可行的。

由表3中的P值可以知道，方程中A、B、C、A2、B2、C2對Y值的影響均高度顯著，表明實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。由回歸方程可知乙醇濃度A與提取溫度C有交互作用。A、C兩因素回歸方程響應(yīng)面及等高線見圖3，兩個交互因素的響應(yīng)面存在最高點(diǎn)，即在所選的范圍內(nèi)存在極值，說明各因素考察范圍較為適當(dāng)。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

注：**.P<0.01為極顯著水平；*.P<0.05為顯著水平。

圖3 提取溫度與提取溶劑濃度對夏至草總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

通過軟件分析得到最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為58.98%、液料比為40∶1，提取溫度為64.76 ℃，在此條件下夏至草總黃酮的提取率為1.607 6%。為使試驗(yàn)操作簡便，最終確定提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、液料比為40∶1、提取溫度為65℃。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取夏至草6份，每份20 g，按2.1項(xiàng)下方法以最佳的提取工藝提取總黃酮，按2.2項(xiàng)下方法顯色，510 nm處測定吸光度，總黃酮含量分別為1.611 1%、1.594 3%、1.564 8%、1.600 1%、1.584 4%、1.599 4%，平均含量為1.592 4%，RSD為1.007 7%，與軟件分析所得的提取率相近，表明本研究確定的試驗(yàn)條件可行。

3 討論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化夏至草活性成分總黃酮的提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度、提取溫度、液料比及的乙醇濃度、提取溫度、液料比平方項(xiàng)對夏至草總黃酮提取率的影響顯著，并且，乙醇濃度與提取溫度具有交互作用。說明乙醇濃度、提取溫度、液料比對夏至草總黃酮提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，超聲功率及超聲時(shí)間對夏至草總黃酮的提取率影響不大，所以在本實(shí)驗(yàn)中未考慮二者的影響，本實(shí)驗(yàn)采用超聲(Hz=120 W)輔助提取10 min。回歸分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法合理可行。得到夏至草總黃酮提取的最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、液料比40∶1、超聲溫度65 ℃，夏至草總黃酮提取率為1.592 4%。

該方法簡便易行，靈敏度高，精密度高，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定可靠，可作為夏至草總黃酮的提取及含量測定方法；為以后夏至草總黃酮的提取和含量測定提供了方法與理論依據(jù)，為新藥開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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