DNA池快速篩查奶牛TLR2 基因多態性及等位基因頻率估算

楊永江，吳恩蕓，禹保軍，劉容秀，馬博妍，岳仁寬，劉麗霞，張 麗

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730030）

TLR2基因是Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）蛋白基因家族的重要成員之一，在機體介導天然免疫和抗病抗感染方面起著重要的作用[1-2]。TLR在機體內分布廣泛，其中TLR2基因主要分布于免疫細胞如單核細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞，協同TLR4連接天然免疫和獲得性免疫[3]。已有大量研究證實，過度的免疫反應所致的自身免疫疾病和慢性炎癥均與TLR2在體內的過度表達有關[4]。TLR2基因識別譜廣，可識別大部分已發現的病原相關分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMP）結構，Beutler等[5]認為TLR2識別PAMP后介導的過激天然免疫應答與敗血癥的發生密切相關。因此，TLR2拮抗劑在疾病的防治和治療中的負調控機制是近年來的研究熱點[6]。NO在機體內起著信使分子的作用，Thoma-Uszynski等[7]的研究結果表明結核分枝桿菌的脂蛋白可通過刺激小鼠的TLR2，從而誘發NO依賴性的殺菌活性。此外在TLR2介導活化效應的大量研究中，單克隆抗體的試圖制備進一步為研制抗感染及信號阻斷新藥品打下基礎[8]。牛TLR2基因定位于17號染色體上[9]，含2個外顯子，基因全長13.2 kb，其中mRNA序列全長3.5 kb，編碼784個氨基酸。

研究表明在乳房炎患病的中國荷斯坦牛乳腺細胞內TLR2呈現過度表達狀態[10]。國內關于TLR2基因在奶牛乳房炎上研究較少。馬騰壑等[11]僅發現1個SNP（single nucleotide polymorphism，SNP）可能與奶牛的乳房炎抗性有關。DNA池技術是提取具有某一共同特征群體DNA為模板按比例混合成池，這種混合DNA樣品再經PCR擴增測序后，結合瓊脂糖凝膠電泳或聚丙酰胺凝膠電泳（PAGE）結合測序可直接檢測出SNPs的一種方法。袁崢嶸等[12]應用DNA池測序技術檢測牛CACNA2D1基因多態性，發現了變異位點，并利用公式估算等位基因頻率。本研究以荷斯坦牛為研究對象，利用DNA池技術和直接測序技術篩選TLR2基因部分序列的SNPs，并通過等位基因頻率的估算，發現SNPs突變前后等位基因頻率有明顯差異，以期為更深入研究荷斯坦牛TLR2基因與乳房炎抗性及分子遺傳育種提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料350頭中國荷斯坦牛血樣，采自寧夏農墾賀蘭山奶業有限公司。每頭牛耳靜脈采血8 mL，裝于真空管中，-20℃保存。采用血液基因組提取試劑盒對DNA進行提取，提取效果利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品濃度用分光光度計進行測量，去離子水溶解稀釋，各DNA樣品吸取1 μL構建DNA池。

1.2 引物設計和PCR反應 根據GenBank中收錄的荷斯坦牛TLR2基因的DNA序列（NM_174197），利用Primer 5.0軟件對4對特異性引物進行設計（表1），用以擴增荷斯坦牛TLR2基因序列。PCR擴增反應總體系為40 μL：基因組DNA 2 μL，上、下游引物各0.9 μL，Taq PCR MasterMix試劑24.2 μL，ddH2O 12 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性4 min；95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，28個循環；72℃延伸10 min，4℃保存，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統進行拍照觀察。

1.3 等位基因頻率估算 利用測序圖看圖軟件Chromas.exe和MWSnap軟件中的標尺，測量荷斯坦牛各突變位點等位基因的峰高，再根據公式Fi=hi/（h1+h2）估算等位基因頻率[13]。其中Fi表示某突變位點等位基因頻率（i=1，2），h1表示測序峰圖中該突變位點等位基因1的峰高度；h2表示測序峰圖中該突變位點等位基因2的峰高度。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

2 結果與分析

2.1 荷斯坦牛TLR 2基因PCR擴增結果 將4對特異性引物C1、C2、C3、C4經DNA池擴增，取產物2 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在150 V，15 min條件下進行擴增（見圖1），分別出現大小約為200～300 bp左右的清晰條帶，與預期目的片段長度相符。

圖1 荷斯坦牛TLR2基因PCR擴增結果Fig.1 Detections of PCR products of TLR2 gene in Holstein cattle

2.2 DNA池擴增產物序列測定及等位基因頻率估算以中國荷斯坦牛DNA池為原料，通過試驗設計的4對引物C1、C2、C3和C4經PCR擴增后進行雙向測序，測序結果比對Genbank中牛TLR2基因發現基因頻率前后有明顯差異，利用Seqman軟件對SNPs進行分析，發現6個SNPs，第2內含子602 bp處胸腺嘧啶（T）→胞嘧啶（C）的堿基轉換和第2外顯子10 900、11 047、11 096和12 077 bp處分別發生鳥嘌呤（G）→胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）→胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）→胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）→胸腺嘧啶（T）的堿基轉換（見圖2），分別命名為T602A、G10900C、G11047C、A11076T和C12077T。其中第2外顯子10 634 bp處發生胸腺嘧啶（T）→鳥嘌呤（G）的堿基轉換，命名為T10634G，導致該基因編碼的蛋白質氨基酸由谷氨酸（Gly）轉變為天冬氨酸（Asp）；另外分別測量中國荷斯坦牛測序峰圖中6個SNPs等位基因相應峰高度，并根據公式給出各突變位點的等位基因頻率估算（見表2）。

表2 等位基因頻率估算Table 2 Estimation of allele frequency

圖2 測序分析結果Fig.2 Results of sequencing

3 討論

本研究用350個中國荷斯坦牛血樣構建了DNA混合池研究TLR2基因，結合直接測序技術和克隆測序技術獲得基因序列，混合樣品某些特異性位點再經過PCR反應后，經瓊脂糖凝膠電泳、測序等方法估算等位基因頻率，確定某位點與對應性狀相關性[14]。DNA池進行直接測序時所要求的頻率應大于10%[15]。利用MWSnap標尺測量測定峰高等位基因頻率小于10%時，會對結果準確度造成一定影響，本研究中突變頻率均大于10%，因此數據可靠。本試驗DNA池構建方式為DNA模板等摩爾混合。因此，DNA定量的精確性對試驗結果會造成相應的干擾，應適當校正。

近年來，在奶牛上國內外對TLR2的研究較少，主要集中于乳房炎抗性標記。馬騰壑等[11]在荷斯坦牛、三河牛和中國西門塔爾牛TLR2基因中鑒定到3個SNPs位點；結果發現，TLR2基因與奶牛乳房炎性狀顯著相關；張翠霞等[16]在中國荷斯坦牛TLR2基因中鑒定出3個SNP位點，結果發現，TLR2基因在奶牛抗病性上有重要作用；白杰等[17]在151頭新疆褐牛和138頭中國荷斯坦奶牛TLR2中鑒定到3個SNPs位點，結果發現，易感乳房炎的突變基因與TLR2基因顯著相關。此外，TLR2在其他臨床研究中也發揮重要功能。伍模鑫等[18]在24例廣東漢族人TLR2基因中鑒定到5個SNPs位點，結果發現，急性關節炎易感性的突變基因與TLR2基因顯著相關；張之宣等在9個地方雞品種，568個樣本TLR2基因中發現6個SNPs位點，結果發現，某位點突變可能與地方雞種抗病性有關。劉勝貴等[1]在豬TLR2基因中鑒定到1個SNP位點，結果發現，TLR2突變位點可作為疾病的診斷標記及經濟性狀上的遺傳標記。

本研究設計4對特異性引物，通過PCR擴增出荷斯坦牛TLR2基因，并結合DNA池技術和直接測序技術研究TLR2基因多態性。結果顯示，在TLR2基因中發現6個SNPs位點，其中G10900C、G11047C、A11076T、C12077T，均屬于同義突變，即未引起編碼氨基酸的改變，首次在第二內含子602 bp、第2外顯子10 634 bp處發現T602A和T10634G，其中T10634G為錯義突變，突變前后氨基酸發生了改變，可能導致蛋白質的功能發生改變，從而影響性狀的表達。對于上述突變位點，下一步將會通過深入研究去探討不同地區的奶牛之間的種間差異性，以精準篩選出寧夏地區荷斯坦牛乳房炎抗性基因的遺傳標記，以期能更好地為中國荷斯坦牛產乳量及乳品質的提升提供理論基礎，更好地將分子生物學技術應用到生產實踐中去。

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