豬圓環(huán)病毒2型2d基因型毒株的鑒定及全基因組序列分析

王宏燕，周晨陽，梁 喬，張 健，楊本勇，顧貴波★

（1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽110164；2.遼寧省動物醫(yī)學研究院，遼寧 沈陽110164）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（porcine respiratory disease complex，PMWS）最主要的病原[1]。PCV基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子，分為PCV1和PCV2兩種血清型，PCV1低致病性或無致病性，基因組全長為1 753 bp，PCV2有致病性，能損傷豬的免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)出多種病癥，基因組全長為1 766～1 768 bp。目前PCV2基因組主要分為4個亞型（PCV2a～PCV2d）[2]，其中PCV2a、PCV2b在世界各地均有發(fā)現(xiàn)，PCV2c在丹麥有過記錄[3]，PCV2d在中國、北美洲和南美洲有過報道[4]，PCV2d在中國的有些地區(qū)已有成為主要流行病毒株的趨勢[5]。本試驗通過臨床病例獲得1株PCV2d全基因組序列，通過比對PCV2的最新流行與變異信息，為有效防控PCV2建立前期基礎。

1 材料與方法

1.1 病料采集及處理 病料來自遼寧省某市某豬場疑似PMWS病死仔豬的肺臟組織、淋巴結(jié)。將肺臟組織及淋巴結(jié)研磨后，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）按照1:5（病料:PBS）稀釋混成勻漿，將勻漿吸入到EP管中，反復凍融3次，3 000 r/min離心20 min，取上清液于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物 根據(jù)Genebank公布的國內(nèi)外PCV2參考毒株序列，合成1對特異性引物，PCV2-F：GTACCTTGTTGGAGAGCGGG，PCV2-R：TCACAGCAGTAGACAGGTCA，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 病料DNA的提取 用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說明書上的操作方法提取組織病料DNA。

1.4 全基因組的擴增 以提取的組織病料DNA為模板進行PCR擴增，PCR采用50 μL反應體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用滅菌超純水補足50 μL。反應條件為：95℃預變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.5 產(chǎn)物回收、鑒定和測序 按照DNA凝膠回收試劑盒說明書，回收、純化特異的DNA條帶。并將回收后的DNA連接到pMD18-T載體上，按照常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，選擇質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果和酶切鑒定結(jié)果均為陽性的重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序。

1.6 序列分析比對 測序所得序列采用DNAStar軟件與國內(nèi)外其他地區(qū)PCV2參考株序列進行同源性比對。利用軟件MEGA 6.06構建系統(tǒng)進化樹，進一步對PCV2全基因進行分子遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 病料PCR鑒定結(jié)果 經(jīng)PCR擴增后，凝膠電泳結(jié)果顯示擴增出片段大小約1 700 bp的條帶（圖1），與預期片段大小相同。

2.2 PCV 2全基因序列同源性分析 測序結(jié)果顯示，該分離株PCV-LNZW1全基因組大小為1 767 bp，與Genbank上收錄的不同國家和地區(qū)的29株PCV2毒株的全基因序列進行了核苷酸序列同源性比對，序列分析結(jié)果見圖2。與29株參考毒株的核苷酸同源性為94.5%～99.9%，其中與PCV2c基因型的參考序列核苷酸同源性較低，為94.5%～94.7%；與PCV2a基因型的參考毒株核苷酸同源性為94.6%～95.4%；與PCV2b基因型的參考序列核苷酸同源性為95.8%～96.4%；與PCV2d基因型的參考序列核苷酸同源性最高，為97.3%～99.9%。在選定的PCV2d基因型序列中，與越南的毒株（Genbank登錄號為JQ181600）的同源性最高，高達99.9%，與國內(nèi)一些省份分離的毒株（Genbank登錄號分別為KX247809、KF027492、KU317493、KX352160）同源性達99.8%。

圖1 PCR檢測結(jié)果Fig.1 The detection of PCV2 by PCR

2.3 PCV 2全基因組遺傳進化樹分析 將PCV-LNZHW1和29條國內(nèi)外參考毒株的全基因組繪制了PCV2系統(tǒng)發(fā)育進化樹（見圖3）。結(jié)果表明，對比的30條毒株明顯分為4個基因型，分別為PCV2-2a、PCV2-2b、PCV2-2c和PCV2-2d，其中本研究中的毒株PCV-LNZHW1位于PCV2-2d分支，因此該毒株屬于PCV2-2d基因型。PCV-LNZHW1與越南、湖南、山西、山東、河北毒株（Genbank登錄號分別為JQ181600、KU317493、KX352160、KF027492、KX247809）的親緣關系最近。

3 討論

本研究通過采集遼寧某市發(fā)病豬場的組織病料，進行PCR擴增測序，獲得1株PCV2毒株，全長1 767 bp，經(jīng)過同源性和遺傳進化樹分析，與PCV2-2d基因型的參考毒株的同源性高達97.3%～99.9%，并在遺傳進化樹上位于同一分支，故PCV-LNZW1株屬于目前我國流行的優(yōu)勢PCV2d基因型。

圖2 PCV2全基因組序列核苷酸序列同源性比對Fig.2 Homology comparison of PCV2 nucleotide genome sequence

圖3 PCV2分離株全基因組核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis among the PCV2 strains on the basis of PCV2 complete genomes

PCV2分為4個主要的基因型：2a、2b、2c和2d，其中2a和2b在很多國家存在和流行，2c型僅在丹麥被發(fā)現(xiàn)且不致病，2d是最近幾年才出現(xiàn)的流行毒株型，國內(nèi)不少省份檢出PCV2-2d基因型，并且有代替PCV2-2b成為我國優(yōu)勢毒株的趨勢[6-9]。起初在遼寧流行的主要是PCV2a和PCV2b基因型，尤其是PCV2b基因型普遍存在[10-12]，通過本研究表明，遼寧出現(xiàn)了PCV2d新的基因型，這符合PCV2目前在我國的流行趨勢。

PCV-LNZW1與29株參考毒株的核苷酸的同源性在94.5%～99.9%之間，表明該毒株與不同地理區(qū)域、不同時間段分離的毒株之間的差異并不顯著，所以推測遼寧地區(qū)PCV2的進化具有相對穩(wěn)定性，主要通過生豬流通等環(huán)節(jié)傳入的可能性極大。

PCV2作為一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，具有較快的基因變異速率，同時個體可感染PCV的多種基因型毒株，不同基因型毒株之間可發(fā)生基因重組[13]，再加上疫苗的高壓免疫狀態(tài)，更加速了PCV2的重組和變異，導致新型變異株的出現(xiàn)，因此應該進一步加強PCV2分子流行病學的監(jiān)測，為有效預防PCV2提供科學依據(jù)。

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