高效液相色譜法測定梔子苷含量的不確定度評定

張玉蓮

（上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，上海200001）

0 引言

高效液相色譜法是以液體為流動相，采用高壓泵輸送，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分經(jīng)選擇性作用被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析[1]。現(xiàn)今，高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于中藥材含量的檢測等領(lǐng)域。在測量中，為評估測量方法的可靠性和測量結(jié)果的可信程度，需要對測量的不確定度進行評價。測量的不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測量值的分散性。測量的不確定度越小，測量的可靠性越大[2]。

本文通過建立高效液相色譜法測定含量的不確定度評定方法，對梔子苷含量測定的不確定度進行評價。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 梔子藥材

梔子藥材為浙江溫州基地直接購買，并經(jīng)上海市中藥行業(yè)專家張增良老師鑒定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis[3]。

1.1.2 主要試劑

乙腈、甲醇（色譜級），購自德國默克公司。

1.2 主要儀器

Agilent1200Series高效液相色譜儀，安捷倫公司；METTLERTOLEDOXS205DU分析天平，梅特勒-托利多公司；Milli-QReference純水機，密理博公司。

1.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（15:85）為流動相；檢測波長為238nm。理論塔板數(shù)按梔子苷峰計算應(yīng)不低于1500。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過四號篩）約0.1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理20min，放冷；再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液10mL，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

本品按干燥品計算，含梔子苷（C17H24O10）不得少于2.0%[3]。

3 不確定度來源和不確定度分量評定

3.1 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中梔子苷的含量M（%）

式中M——樣品中梔子苷的含量（%，g/100g）；

C——標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度，mg/mL；

V——供試品溶液的稀釋倍數(shù)；

W——供試品的稱樣量，g；

A樣——供試品峰面積；

A對——對照品峰面積。

3.2 不確定度的來源分析

從樣品實驗操作過程分析來看，高效液相色譜法測定梔子苷含量引入的不確定度因素主要有以下幾個方面：對照品溶液的濃度、供試品溶液的濃度、高效液相色譜法測定時的重復(fù)性。

其中：（1）對照品溶液濃度產(chǎn)生的不確定度因素主要包括對照品的純度、對照品稱量、對照品配制；（2）供試品溶液濃度產(chǎn)生的不確定度因素主要包括供試品稱量、供試品提取、供試品配制；（3）高效液相色譜法測定時的不確定度因素主要包括儀器測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度。

圖1為梔子苷含量測量的不確定度因素分析。合成不確定度urel（M）

式中urel（1）——對照品溶液濃度引入的不確定度；

urel（2）——供試品溶液濃度引入的不確定度；

urel（3）——重復(fù)性測量制備引入的不確定度。

3.3 分量的計算

3.3.1 對照品溶液濃度引入的不確定度

對照品溶液濃度引入的不確定度因素包括：對照品純度、對照品稱量、對照品配制過程。

對照品溶液濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（1）=

3.3.1.1 對照品純度引入的不確定度

圖1 梔子苷含量測量的不確定度因素分析

經(jīng)查本次實驗用的梔子苷對照品（批號：110749-201718，中國藥品生物制品檢定所，純度97.6%），對照品未給出不確定度，該項忽略，即對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（純度）=0。3.3.1.2 對照品稱量引入的不確定度

（1）天平型號為METTLERTOLEDOXS205DU，稱取對照品15.27mg。經(jīng)查電子天平的檢定證書，電子天平的稱量擴展不確定度為0.36mg（k=2），即稱量不確定度

（2）由于去皮稱量，故示值誤差的不確定度可以抵消，即示值不確定度u2=0。

（3）天平示值重復(fù)性不確定度，連續(xù)稱重10mg的標(biāo)準(zhǔn)砝碼10次，得到電子天平稱量的重復(fù)性不確定度u3=0.01068mg。

（4）由于去皮稱量，必須計算兩次：

稱重標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為標(biāo)準(zhǔn)不確定

度除以稱量，得

3.3.1.3 對照品溶液的制備過程引入的不確定度

對照品濃度為30μg/mL，配制時先稀釋至50mL容量瓶中，再吸取1mL稀釋至10mL容量瓶中。該部分引入的不確定度因素主要有以下幾個方面：玻璃容器的校準(zhǔn)、溫度效應(yīng)、定容重復(fù)性。

（1）由玻璃容器校準(zhǔn)引入的不確定度：

20℃時，50mL（A級）容量瓶最大允差為±0.05mL，10mL（A級）容量瓶最大允差為±0.02mL，1mL移液槍的最大允差為±1μL，按矩型分布，取k=

50mL容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V50）=

10mL容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V10）=

1mL移液槍校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V1）=

（2）由溫度效應(yīng)引入的不確定度：

經(jīng)統(tǒng)計，實驗室的溫差為±2℃，假設(shè)矩形分布，取k=水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4。

50mL容量瓶溫度效應(yīng)引入的不確定度u2（V50）=

10mL容量瓶溫度效應(yīng)引入的不確定度u2（V10）=

1mL移液槍溫度效應(yīng)引入的不確定度u2（V1）=

（3）由定容體積重復(fù)性引入的不確定度：

對50mL、10mL容量瓶、1mL移液槍加水定容至刻度，連續(xù)操作10次，稱重得到：

50mL容量瓶定容重復(fù)性引入的不確定度u3（V50）=0.0391mL；

10mL容量瓶定容重復(fù)性引入的不確定度u3（V10）=0.0070mL；

1mL移液槍定容重復(fù)性引入的不確定度u3（V1）=0.0008mL。

（4）對照品溶液的制備過程引入的不確定度結(jié)果：

對照品溶液的制備過程中，50mL容量瓶引入的 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 ：u

容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為標(biāo)準(zhǔn)不確定度除以標(biāo)示容量，得：制備過程50mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V50）

對照品溶液的制備過程中，10mL容量瓶引入標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 ：u

制備過程10mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

對照品溶液的制備過程中，1mL移液槍引入的標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 ：u

制備過程1mL移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

對照品配制過程的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3.1.4 對照品溶液濃度引入的不確定度分量

對照品溶液濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

3.3.2 供試品溶液濃度引入的不確定度

3.3.2.1 供試品溶液稱量引入的不確定度

（1）所用天平為METTLERTOLEDOXS204，稱取0.10g。經(jīng)查天平檢定證書，電子天平的稱量擴展不確定度為0.36mg（k=2），稱量不確定度u10.18mg。

（2）由于去皮稱量，故示值誤差的不確定度可以抵消，即示值不確定度u2=0。

（3）天平示值重復(fù)性誤差，取0.1g標(biāo)準(zhǔn)砝碼連續(xù)稱重10次，得到電子天平稱量的不確定度u3=0.03162mg。

（4）由于去皮稱量，必須計算兩次：

稱重引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定u（稱量）=

稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（稱量0.0026。

3.3.2.2 供試品提取引入的不確定度

供試品提取所產(chǎn)生的回收率有著不確定性。由于樣品提取不完全，使得梔子苷不能被全部提取到溶液中，因此采用加標(biāo)回收率實驗，連續(xù)測試6次，測得供試品提取回收率分別為98.6%、99.0%、99.1%、98.7%、99.5%、100.1%，按極差法計算：

供試品提取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（提?。?

3.3.2.3 供試品配制過程引入的不確定度

供試品配制階段，需使用25mL容量瓶、25mL移液管和10mL移液管，此過程的不確定度分量計算如下：

（1）由玻璃容器校準(zhǔn)引入的不確定度：

20℃時，25mL（A級）容量瓶最大允差為±0.03mL，25mL移液管的最大允差為±0.01mL，10mL移液管的最大允差為±0.02mL，按矩型分布，取k=

25mL容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u容1（V25）=

25mL移液管校準(zhǔn)引入的不確定度u移1（V25）=

（2）由溫度效應(yīng)引入的不確定度：

經(jīng)統(tǒng)計，實驗室的溫差為±2℃，假設(shè)矩形分布，取k=

10mL移液管校準(zhǔn)引入的不確定度u移1（V10）=水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4。

25mL容量瓶溫度效應(yīng)引入的不確定度u容2（V25）=

25mL移液管溫度效應(yīng)引入的不確定度u移2（V25）=

10mL移液管溫度效應(yīng)引入的不確定度u移2（V10）=

（3）由定容體積重復(fù)性引入的不確定度：

對25mL容量瓶、25mL移液管和10mL移液管，加水定容至刻度，連續(xù)操作10次，稱重得到：

25mL容量瓶定容重復(fù)性引入的不確定度u容3（V25）=0.0213mL；

25mL移液管定容重復(fù)性引入的不確定度u移3（V25）=0.0079mL；

10mL移液管定容重復(fù)性引入的不確定度u移3（V10）=0.0095mL。

（4）供試品配制過程引入的不確定度：

供試品配制過程中，25mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度 ：u容配制過程中25mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

供試品配制過程中，25mL移液管引入的標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度 ：u移配制過程中25mL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

供試品配制過程中，10mL移液管引入的標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度 ：u移配制過程中10mL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

供試品溶液配制過程合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3.2.4 供試品溶液濃度引入的不確定度分量

供試品溶液濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

3.3.3 儀器重復(fù)性測量引入的不確定度

對同一樣品連續(xù)測定6次，測定得到梔子苷的含量分別為3.53%、3.58%、3.61%、3.60%、3.58%、3.62%，測量平均值=3.59%，極差為0.09%。

按平均值=3.59%計算重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

3.3.4 梔子苷含量測量的相對合成不確定度

梔子苷含量測量的相對合成不確定度：

4 結(jié)果與討論

4.1 結(jié)果

梔子苷含量測量的不確定度結(jié)果如下：

（1）測量平均值M=3.59%；

（2）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc（M）=M×uc，rel（M）=3.59%×0.0210=0.08%；

（3）擴展不確定度：在95%置信概率下，取包含因子k=2，將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子計算得到測量結(jié)果的擴展不確定度：U=k×uc（M）=2×0.08%=0.16%；

（4）被測梔子藥材中梔子苷的含量為3.59%±0.16%，k=2。

4.2 討論

（1）在不確定度評估中，需根據(jù)實驗過程充分考慮各個影響因素[4]。本實驗經(jīng)對梔子苷含量測定的各不確定度分量進行分析評估，在影響梔子苷含量測定不確定度的各因素中，對照品稱量、重復(fù)性測量、供試品溶液的提取引入的不確定度對檢驗結(jié)果的影響較大。在實驗中，應(yīng)加強對稱量過程、儀器性能狀態(tài)以及樣品溶液提取過程的控制。

（2）在實驗過程中，溫度效應(yīng)會對實驗中使用的玻璃容器帶來不確定度，影響實驗結(jié)果，在實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格控制檢測環(huán)境的溫度波動。

（3）對照品純度的不確定度也會影響實驗結(jié)果，由于本實驗所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)未提供不確定度，故本實驗忽略該項因素。

[1]武漢大學(xué)化學(xué)系.儀器分析[M].北京：高等教育出版社，2001.

[2]化學(xué)分析中不確定度的評估指南：CNAS-GL06[S].

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[4]王維劍，凌霄，譚會潔，等.HPLC法測定中藥中摻入雙氯芬酸鈉含量的不確定度評定[J].藥物分析雜志，2009，29（1）：130-133.