葡萄糖-6-磷酸脫氫基因檢測技術在蠶豆病診斷中的應用

羅家宏

（廣東省江門市婦幼保健院醫學遺傳中心 江門 529000）

蠶豆病是一種X連鎖不完全顯性遺傳性溶血性疾病，其實質是G6PD基因發生突變，故又被稱之為G6PD缺乏癥。該病男性發病率高于女性，致病機制是G6PD基因發生突變，編碼蛋白結構受到影響進而引起G6PD酶的活性降低[1]。該病在世界范圍內約4億人受累，以地中海周圍、印度、東南亞等地區高發。我國分布于海南、廣東、廣西、云南等地，發病率在11%左右，極個別地區可達30%以上[2]。為進一步探究診斷效果，本研究將我院收治的128例蠶豆病患者作為研究對象，探討不同檢測技術在蠶豆病診斷中的應用價值。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 對我院2016年12月～2017年12月收治確診為蠶豆病的128例患者進行分析，男78例，女50例，年齡 21～62歲，平均（39.44±3.51）。均進行熒光定量PCR法檢測及高鐵血紅蛋白還原法檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑 BeckmanCoulter DXC800全自動生化分析儀、ABI 7500熒光PCR儀。高鐵血紅蛋白還原實驗MHBR試劑（2.5%的NaNO2和0.000 4 M美蘭等量混合），引物（美國Invitrogen公司），Hot Star Taq酶（德國Qiagen公司）。

1.2.2 檢測方法 熒光定量PCR法：對128例患者EDTA抗凝靜脈血用QIAamp DNA Blood Mini Kit按照說明書提取DNA，－20℃保存，以熒光PCR方法為技術原理，通過設計特異的Taqman探針對6 個 常 見 突 變 位 點（G1376T、G1388A、A95G、A871G、G392T、C1024T）進行合管檢測，以有無擴增曲線做定性突變檢測，同時以人類基因組的β-actin基因為模版設計擴增引物對實驗進行內控監測。模板制備和引物、探針設計合成按QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書操作提取外周血DNA，－20℃保存。多重PCR引物和特異識別突變位點的Taqman MGB探針設計用Primer Express 3.0軟件完成，由上海英濰捷基公司合成。PCR體系及程序PCR體系：G6PD基因A、B兩管三重PCR擴增PCR反應總體積均為25 μl，包括DNA模板2 μl（總量 20～100 ng），10×Hot Star Taq PCR 緩沖液2.5 μl，25 mmol/L 的 MgCl溶液 21.5 μl，25 mmol/L的 dNTPs 0.2 μl，10 μmol/L 的特異性擴增上、下游引物對 0.5～1.0 μl，10 μmol/L 的 Taqman MGB 探針0.5～0.9 μl，10 μmol/L 的 β-actin 上、下游擴增引物0.4 μl，10 μmol/L 的 β-actin Taqman 探針 0.4 μl，滅菌水補足至25 μl。PCR程序：94℃預變性5 min；94℃15 s，69℃32 s，共 40個循環；69℃32 s采集熒光信號。高鐵血紅蛋白還原法：肝素抗凝血，調整血漿與紅細胞比例約1∶1；用移液器吸取50 μl全血加入 50 μl的 MHBR 試劑，混勻，37 ℃4 h；再加入雙蒸水4.9 ml，混勻，2 min后顯色觀察結果：呈鮮紅色者為正常；呈棕色、棕紅色或紫色為缺乏。

1.3 觀察指標 觀察所有患者檢測結果，比較兩組診斷價值。

1.4 統計學處理 實驗結果用統計軟件SPSS19.0展開分析，計數資料采用例（%）表示，行χ2檢驗，P＜0.05代表組間數據無顯著差異。

2 結果

熒光定量PCR法檢測及高鐵血紅蛋白還原法檢測的診斷準確率分別為99.22%、85.94%，P＜0.05。見表1。

表1 對比兩組診斷準確度[例（%）]

3 討論

蠶豆病患者臨床表現變化不一，有些患者無任何癥狀，而有些則發生新生兒黃疸、急性溶血等，嚴重者可出現新生兒期重癥核黃疸，造成死亡或永久性神經系統的損傷。因此早期診斷顯得尤為重要[3]。

蠶豆病有很多種檢測方法，高鐵血紅蛋白還原法就是其中之一，但該方法受主觀因素影響大，酶法對雜合子的檢出率不理想，結果為弱陽性時，容易出現主觀誤判，會出現模棱兩可的情況，臨床診斷效果不佳[4～5]。厲勇等[6]研究表示，可對蠶豆病采用熒光定量PCR法進行檢測診斷，其診斷準確率可達99.00%。本研究結果表明，熒光定量PCR法檢測準確率比高鐵血紅蛋白還原法檢測高（P＜0.05）。熒光PCR檢測方法具有以下優勢：（1）結果能確定患者基因型，便于患者進行產前診斷；（2）檢測耗時短，1 h內即可完成；（3）結果清晰直觀，易于判斷和分析；（4）熒光PCR法中檢測的6個突變位點能涵蓋大部分蠶豆病基因。本研究存在的不足與局限性：（1）樣本選取存在一定局限性，主要以2017年的患者為初始樣本，雖然按相應的標準進行了篩選，但所選取的標本是否合理有待商榷；（2）樣本選取例數較少，臨床可進一步擴大研究對象人數，提升準確性。

綜上所述，對蠶豆病患者采用熒光定量PCR法檢測，其診斷準確率較高，耗時短，此方法在臨床上值得進一步推廣使用。

[1]余超,于潔,憲瑩,等.兒童G6PD缺乏癥355例臨床分析[J].中國小兒血液與腫瘤雜志,2015,20(3):126-130

[2]張麗蕓,馬鑫,于布為.蠶豆病合并脊柱側彎患者行房間隔缺損修補術一例[J].臨床麻醉學雜志,2016,32(3):312

[3]中華預防醫學會出生缺陷預防與控制專業委員會新生兒篩查學組,中國醫師協會醫學遺傳醫師分會臨床生化遺傳專業委員會,中國醫師協會醫學遺傳醫師分會臨床生化遺傳專業委員會中國醫師協會青春期醫學專業委員會臨床遺傳學組,等.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥新生兒篩查、診斷和治療專家共識[J].中華兒科雜志,2017,55(6):411-414

[4]張格,于潔,李蕙,等.31例G6PD缺乏癥患兒基因突變與臨床表現分析[J].中國小兒血液與腫瘤雜志,2015,20(6):299-304

[5]包和婧,朱立新,梁永豪,等.骶尾部卵黃囊瘤合并蠶豆病1例[J].廣東醫學,2014,35(11):1808

[6]厲勇,楊明,菲肖琨.貴陽地區新生兒G6PD酶篩查結果分析[J].中國實驗診斷學,2014,18(7):1171-1172