常壓高濃度氧對腦缺血-再灌注大鼠缺血核心區核轉錄因子-κB的適度調節作用

師文娟 趙詠梅 戚智鋒 黃語悠 房亞蘭 劉克建

(首都醫科大學宣武醫院 北京市老年病醫療研究中心 腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京100053)

缺血性腦卒中是一種由于腦組織局部區域血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性病變壞死、進而產生神經功能缺失的高發疾病。缺血再灌注過程中涉及炎性級聯反應，導致神經細胞死亡或凋亡，加重缺血性損傷，因此干預腦缺血后的炎性反應是較為有效的治療方案。腦缺血炎性反應受到多種基因調節，其中核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)作為細胞內信號轉導的樞紐，在炎性反應中起關鍵作用，成為抗腦缺血炎性損傷的重要靶點[1]。

在神經系統中，NF-κB 廣泛分布于神經元、神經膠質細胞和血管內皮細胞中，由p65或p50亞基形成二聚體，最常見的NF-κB亞基組成形式為p65/p50或p65/p65[2]。腦缺血再灌注損傷時 NF-κB活化后轉位進入細胞核并與特定的DNA序列結合，誘導啟動靶基因的轉錄及表達，從而激活炎性反應因子及細胞因子，導致缺血后炎性級聯反應的發生[3]。NF-κB主要受其抑制劑(inhibitor of κB，IκB)蛋白調節[4]。白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)是一種可由NF-κB介導產生的重要炎性因子，它可通過促使白細胞浸潤和血小板黏附內皮細胞以及其他多種途徑造成細胞和組織的損害[5]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)也是重要的炎性反應介質，在缺血后受NF-κB調控可引起神經細胞的炎性損傷[6]。

常壓高濃度氧(normobaric hyperoxia, NBO)治療是一種能夠直接改善缺血腦組織氧合狀態的有效易行的療法，在恢復腦組織氧分壓方面有顯著功效，這種保護歸因于NBO 具有提高缺血腦組織能量代謝的能力，已經證實NBO治療能增加大腦血流量和氧輸送，從而可對腦缺血再灌注損傷涉及的一系列復雜病理過程予以干預保護[7]。然而方便易行的NBO能否成為抵抗缺血炎性反應的潛在治療方式從而用于腦卒中的救治值得探究，目前尚沒有直接證據顯示，NBO對NF-κB引發的缺血后炎性反應是否具有調節作用，本研究旨在利用大鼠腦缺血再灌注模型，研究NBO治療對腦缺血核心區IL-1β因子、TNF-α因子、NF-κB蛋白及其抑制蛋白IκB的影響，為缺血性腦卒中治療的干預策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

小動物麻醉機(Harvard Apparatus公司，美國)、手術顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、雙極電凝器(德威公司，中國)、冷凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)、正置熒光顯微鏡(Nikon公司80i，日本)、化學發光系統(Chemi Scope公司，中國)。

1.2 實驗材料

SPF級雄性SD大鼠15只，體質量280～320 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0001。恩氟烷購自河北一品制藥公司；NF-κB p65抗體、IκB抗體、IL-1β抗體、TNF-α抗體購自美國CST公司；OCT冰凍切片包埋劑、GAPDH抗體、HRP標記山羊抗小鼠/ 兔二抗購自北京中杉金橋公司；抗兔熒光二抗購自美國Invitrogen公司等。

1.3 動物模型制作及取材

依據數字表法隨機將SD大鼠分為Sham組(n=3)、Normoxia組(n=6)和NBO組(n=6)。稱體質量后，先使用5%(體積分數)恩氟烷誘導麻醉大鼠，后使用2%(體積分數)恩氟烷混合70%(體積分數)N2O及30% (體積分數)O2維持麻醉狀態。按照改良的Longa線栓法[8]制備大鼠大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)缺血再灌注模型：于大鼠頸部正中切口，鈍性分離暴露右側頸總、頸內及頸外動脈；電凝頸外動脈后，在頸外動脈殘端剪口，將線栓插入頸內動脈，至線栓頂端距離頸總動脈分叉處約1.8～2.0 cm且遇阻力感時停止。術中監測大鼠心率、血壓及肛溫，保持各項生理參數在正常范圍。阻斷血流90 min后，拔出線栓恢復血流灌注。Sham組大鼠進行手術及插栓操作后即刻拔出線栓恢復血供。NBO組大鼠于缺血5 min后，置于通入100%(體積分數)O2的麻醉盒中，其他兩組大鼠置于空氣環境。再灌注24 h處死大鼠取腦，于視交叉處作冠狀切片，向前囟方向切2 片，小腦方向切4 片，每片厚度約2 mm。留取第3片腦組織用作Western blotting檢測，第4 片腦組織速凍包埋后用作冰凍切片。依據文獻[9-10]報道缺血核心區的病理特征及位置分布，選取缺血側腦片中線旁開5.5 mm的外側皮質為核心區范圍。

1.4 Western blotting檢測

選取缺血核心區腦組織，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑后置于冰上勻漿，冰浴30 min后于4 ℃，12 000 g離心30 min，BCA法測定上清液蛋白濃度。加入上樣緩沖液，95 ℃水浴10 min，行SDS-PAGE電泳分離，以90 V恒定電壓轉膜100 min。5%(質量分數)脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別置于對應一抗溶液中4 ℃孵育過夜，NF-κB p65抗體(1∶1 000)，IκB抗體(1∶1 000)，GAPDH抗體(1∶1 000)。次日以TBST漂洗印跡膜5 min，重復3次；加入HRP標記的山羊抗小鼠/兔二抗(1∶6 000)，室溫孵育1 h。吸去二抗，以TBST漂膜5 min，重復3次；在膜上滴加化學發光液顯影，使用化學發光系統掃描分析。蛋白水平用NF-κB p65或IκB與相應GAPDH的條帶灰度比值表示。

1.5 免疫熒光檢測

大鼠腦組織經OCT包埋后，行厚度為20 μm的冰凍切片。將切片置于預冷丙酮中固定10 min，PBS洗兩次，加0.3%(體積分數)TritonX-100對切片進行破膜通透10 min，PBS洗兩次，加5%(質量分數)BSA室溫封閉1 h后分別滴加對應一抗 (NF-κB 1∶200， IL-1β 1∶200，TNF-α 1∶200)，4 ℃ 孵育過夜。 PBS漂洗切片3次，每次5 min；滴加熒光二抗(1∶300)，室溫避光孵育1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；用含DAPI染料的防熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 NBO治療抑制大鼠腦缺血核心區IL-1β的表達

免疫熒光染色結果顯示，Sham組大鼠大腦組織偶見微弱熒光染色。與Sham組相比，Normoxia組大鼠缺血核心區IL-1β陽性細胞數目增多，差異有統計學意義(P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組大鼠缺血核心區IL-1β陽性細胞數目減少，差異有統計學意義(P<0.05)，熒光強度也有所減弱(圖1)。

2.2 NBO治療抑制大鼠腦缺血核心區TNF-α的表達

免疫熒光染色結果顯示，Sham組大鼠大腦組織偶見微弱熒光染色。Normoxia組大鼠缺血核心區TNF-α陽性細胞數目較Sham組增多，差異有統計學意義(P<0.05)；NBO組大鼠缺血核心區TNF-α陽性細胞數目較Normoxia組減少，差異有統計學意義(P<0.05)，熒光強度也有所減弱(圖2)。

圖1 免疫熒光檢測大鼠腦缺血核心區IL-1β表達Fig.1 Immunofluorescence staining of IL-1β in the core ischemic region of rats following cerebral ischemia

圖2 免疫熒光檢測檢測大鼠腦缺血核心區TNF-α表達Fig.2 Immunofluorescence staining of TNF-α in the core ischemic region of rats following cerebral ischemia

2.3 NBO治療對大鼠腦缺血核心區NF-κB活化有一定程度的抑制作用

免疫熒光結果顯示，NF-κB p65被綠色熒光二抗標記，Sham組大鼠腦組織顯示微弱熒光染色。不同實驗組間NF-κB p65發生入核轉移的陽性細胞數的差異代表其NF-κB活化程度有所不同。與Sham組相比，Normoxia組缺血核心區NF-κB p65熒光強度明顯增強， NF-κB p65胞核染色陽性的細胞數量明顯增多；與Normoxia組相比，NBO組缺血核心區NF-κB p65入核陽性細胞數目減少、熒光強度減弱，表明NF-κB活性受到一定程度的抑制，詳見圖3。

Western blotting檢測結果顯示與Sham組相比，實驗組缺血核心區NF-κB p65濃度均有所升高；與Sham組相比，Normoxia組缺血核心區NF-κB p65蛋白濃度升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組缺血核心區NF-κB p65蛋白濃度降低，差異有統計學意義(P<0.05)，說明NBO對缺血-再灌注大鼠缺血NF-κB的活化有一定程度的抑制作用，詳見圖4A。

2.4 NBO治療抑制大鼠腦缺血核心區IκB蛋白的降解

Western blotting檢測結果顯示：與Sham組相比，Normoxia組缺血核心區IκB蛋白濃度降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組缺血核心區IκB蛋白濃度升高，差異有統計學意義(P<0.05)；NBO組缺血核心區IκB蛋白濃度與Sham組差異不明顯，詳見圖4B。

3 討論

研究[11]表明炎性反應所致的繼發性損害是腦缺血損傷的主要原因，由于核轉錄因子NF-κB可以調節多種炎性因子轉錄及表達，因而被認為是腦缺血后炎性級聯反應的始動因素，參與了腦缺血損傷的發生及發展的主要過程，因此在腦缺血病程中對NF-κB進行干預可能會是較為有效的治療策略。

NF-κB在神經元、 神經膠質細胞和腦血管內皮細胞中通常有較低量的表達，它在炎性反應因子的轉錄環節起著關鍵性作用。缺血時NF-κB被激活，活化的NF-κB可促使IL-1β、 TNF-α等炎性因子表達上調，反之這些因子也可以激活NF-κB，從而使NF-κB的活化在組織間不斷擴散，加重炎性反應[12]。研究[13]表明抑制NF-κB活化是減輕腦缺血炎性損傷的重要途徑，由于NF-κB是腦缺血炎性反應的中心環節，所以拮抗NF-κB的活化，可能起到有效的抗炎效果，從而發揮腦保護作用；而IκB的降解是NF-κB活化的重要條件，抑制或減少IκB降解可抑制NF-κB的活化[14]。本研究中NBO組缺血核心區IκB蛋白濃度較Normoxia組明顯升高，說明NBO治療顯著抑制了缺血核心區IκB蛋白的降解。

圖3 免疫熒光檢測檢測大鼠腦缺血核心區NF-κB p65活化水平Fig.3 Immunofluorescence staining of NF-κB p65 in the core ischemic region of rats following cerebral ischemia

然而，NF-κB在腦缺血病程中的作用具有雙面性，一方面活化的NF-κB 通過促進炎性反應的發生發展、誘導細胞凋亡、介導自由基損傷等途徑，加重腦缺血損傷[15]；另一方面NF-κB的抑制細胞凋亡機制對于保護缺血性腦損傷具有重要作用[16]。因此適度抑制NF-κB 的活化對治療腦缺血再灌注損傷疾病將會有很大價值，但同時需要關注的是還要將NF-κB的活性控制在一定的范圍內，這將成為腦缺血性損傷疾病干預的新策略。本研究免疫熒光結果顯示NBO治療組缺血核心區NF-κB活化發生核轉位的細胞數目較Normoxia組明顯減少，但仍多于Sham組，說明NBO治療既可維持NF-κB轉錄因子一定程度的激活狀態，有利于抑制凋亡、啟動機體自身保護機制；又可防止其過度活化，從而抑制炎性因子的表達，免疫熒光檢測顯示NBO治療組缺血核心區IL-1β及TNF-α表達比Normoxia組顯著減少，說明NBO治療具有抗炎作用進而減輕腦缺血損傷。以上結果綜合提示NBO治療可能通過適度調節缺血核心區NF-κB的活化程度以發揮腦保護作用。

腦缺血性損傷根本致病原因是局部腦血管血流不暢導致的缺血缺氧，給予常壓高濃度治療恰是針對性地幫助缺血組織恢復氧分壓，可以避免引入化學藥物干預因素，減輕其他附加影響，可能對于一些在腦缺血再灌注損傷中具有雙重作用的關鍵靶點起到適度調節的效果，有助于為腦缺血性損傷疾病干預方式提供新的思路和策略。

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