腦缺血再灌注損傷中自由基與鋅離子的相互作用

房亞蘭 尹 潔 劉克建 趙詠梅

(首都醫科大學宣武醫院 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室，腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100053)

腦缺血后再灌注可挽救瀕臨死亡的細胞，使某些可逆性損傷獲得功能上的恢復。但缺血后的血流恢復能進一步導致組織損傷和功能障礙，稱為缺血再灌注損傷。降低再灌注損傷被認為是治療缺血性腦卒中的關鍵。近年來的研究[1-2]表明，腦缺血再灌注不但誘導大量的自由基產生，引發氧化應激，而且引起細胞內鋅離子(Zn2+)大量聚集。本文擬對腦缺血再灌注損傷過程中自由基與Zn2+的相互關系進行闡述。

1 腦缺血再灌注時自由基的產生途徑及損傷機制

最近的研究[8]表明，再灌注24 h內，在大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的半暗帶區內ROS隨再灌注時間延長遞增，且ROS量與腦梗死體積比率呈正相關。給予MCAO大鼠線粒體ROS抑制劑，可顯著降低大鼠再灌注后6 h腦內ROS的產生，減少腦梗死體積，說明ROS在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用[9]。研究[10]顯示，缺血后錐體神經元內自由基的產生與線粒體通透性改變相關。線粒體通透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)開放引起促凋亡蛋白釋放，例如凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor, AIF)和細胞色素C，后者可激活Caspase-9，進而激活Caspase-3，引起細胞凋亡[10]。因此，腦缺血后，自由基可通過引發細胞凋亡途徑參與神經細胞的損傷過程。

2 腦缺血再灌注后腦組織內Zn2+的變化及作用

鋅元素是體內必需的微量元素之一，但過量的鋅有細胞毒性，導致細胞凋亡。生理條件下，Zn2+和谷氨酸一起儲存在神經元的突觸囊泡中，受到刺激時，Zn2+釋放入突觸間隙，作用于突觸后的鋅結合位點[11]。此外，金屬硫蛋白(metallothionein, MT)結合大量的Zn2+，其中MT3對于保持神經元中的鋅穩態有重要作用[12]。Zn2+也聚集于線粒體基質中，線粒體內的Zn2+流可通過去極化以及mPTP的開放導致胞質內Zn2+水平增加[13]。除此之外，胞內其他結合位點也可能釋放Zn2+，調控缺血后Zn2+水平的病理性上升。研究[2]表明，MCAO大鼠腦梗死半暗帶區域內，Zn2+陽性細胞數目在再灌注24 h內遞增，且Zn2+陽性細胞數目與腦梗死體積比率呈正相關，說明Zn2+參與腦缺血再灌注損傷。

筆者的研究[2]表明，MCAO大鼠腦內半暗帶區Zn2+與凋亡神經元共定位。應用特異性鋅離子螯合劑N，N，N′,N′-4(2-吡啶甲基)乙二胺[N，N，N′,N′-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine, TPEN]顯著減少缺血大鼠腦半暗帶區Zn2+與凋亡神經元數目，減小腦梗死體積，改善神經功能，且這種保護作用可持續至再灌注后的第14天，首次證明Zn2+在腦缺血損傷中有重要作用[2]。筆者的研究[14]還顯示，過量的鋅積累于缺血大鼠的微血管，TPEN顯著改善缺血大鼠腦內微血管的通透性，說明鋅釋放和積累導致腦缺血后的血-腦脊液屏障損害。

缺血后Zn2+對神經元線粒體的作用機制十分復雜。Zn2+可抑制線粒體的電子傳遞，不可逆地阻斷重要的線粒體基質酶，進而導致mPTP激活[13]。缺血條件下，內源性Zn2+與線粒體功能紊亂密切相關。鋅離子螯合劑可減少缺血起始階段線粒體細胞色素C釋放，抑制Caspase 3激活。亞微摩爾濃度的Zn2+可同時引起線粒體內膜多個離子通道激活以及mPTP開放[15]，引起凋亡。

除了影響線粒體功能外，Zn2+也參與調節細胞的其他代謝過程。如在缺血條件下，Zn2+調節AMPA通道、紅藻氨酸通道(Ca-A/K通道)GluR2亞基表達，增加Ca-A/K通道對鈣離子(Ca2+)的通透性[16]。Zn2+也可以通過激活膜上MAPKs家族介導神經元損傷[17]。然而另有研究[18]表明，Zn2+調控轉錄因子表達是預適應的保護機制之一。以上關于鋅離子在腦缺血再灌注損傷中的相關研究，說明鋅離子是一個非常關鍵的靶點，具有重要的研究意義和廣闊的應用前景。

3 Zn2+與自由基引發的氧化應激損傷之間的相關性

Zn2+和ROS在缺氧缺血性應激過程中積累，并在病理過程中起重要作用。Zn2+是一種潛在的有毒陽離子，參與腦缺血、癲癇和腦外傷中的神經元損傷。一方面，Zn2+發揮其神經毒性的機制包括導致線粒體和線粒體外產生活性氧簇，以及破壞代謝酶的活性，最終導致凋亡和/或壞死過程的激活。各種針對Zn2+毒性的神經保護措施能夠降低Zn2+引起的ROS生成。另一方面，細胞內Zn2+穩態對病理生理環境變化敏感，如氧化應激、酸中毒或炎性反應。抗氧化劑能夠減弱Zn2+的神經毒性，這些都證明Zn2+與氧化應激損傷之間密切相關。

4 腦缺血再灌注過程中Zn2+對氧化應激的調控作用

近年來，腦缺血再灌注后Zn2+對氧化應激的影響受到關注。文獻[19-25]報道，Zn2+可促進自由基產生，引起氧化應激損傷。本課題組的研究[19]顯示，鋅超載導致缺血神經元線粒體功能障礙。細胞內升高的Zn2+可通過線粒體內級聯反應促使ROS生成。有研究[20]表明，腦缺血時線粒體對Zn2+的攝取增加，線粒體內快速大量聚集的Zn2+通過抑制電子傳遞鏈的復合體Ⅲ的激活或干擾復合體Ⅰ和α-酮戊二酸脫氫酶促使大量的ROS產生，ROS能夠引起線粒體膜電位變化，使線粒體功能喪失。盡管Zn2+與Ca2+都可引起上述變化，然而與Ca2+相比，由Zn2+介導的線粒體功能失調的作用更為強烈[20]。

Zn2+升高后也可通過非線粒體途徑引發Zn2+依賴性的氧化應激反應。在培養的神經元中，Zn2+可以激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)，進而導致NADPH氧化酶激活，促使NOS生成，同時ROS、NO會相應增加[21]。另一種可能方式是通過nNOS介導，由于局灶性腦缺血時nNOS陽性神經元增加，此途徑可能參與了腦缺血損傷[22]。

Zn2+通過線粒體損傷或NADPH氧化酶激活引起氧化應激反應，進而促進ROS產生，誘導DNA鏈斷裂，導致DNA修復酶-多聚核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP]激活。過量的PARP通過以NAD+作底物催化蛋白質的多聚(ADP-核糖基)化，導致NAD+大量消耗、糖代謝障礙、ATP缺失。應用NADPH氧化酶、NOS或PARP的阻斷劑均可抑制Zn2+破壞神經元[23]。PARP激活誘導線粒體釋放AIF，促進AIF轉入核內，引起非Caspase依賴的DNA斷裂及細胞死亡。此外，PAR(PARP的多聚體產物)可以直接誘導AIF釋放[26]。體內研究[2]表明，腦缺血導致PARP-1的裂解和激活，而螯合Zn2+后PARP-1的裂解和激活都降低，說明Zn2+參與PARP-1的裂解和激活，促進神經細胞死亡。

Zn2+也通過溶酶體介導細胞死亡。有研究[27]顯示，暴露在H2O2或毒性水平的Zn2+環境時，溶酶體內鋅迅速增加，導致膜的完整性破壞，溶酶體釋放組織蛋白酶，最終海馬區神經元通過鋅、組織蛋白酶途徑死亡。這些結果顯示，鋅是氧化應激和溶酶體膜通透性連接的紐帶，溶酶體鋅超載和溶酶體損壞是神經元氧化應激死亡的關鍵步驟。

盡管一些研究[20,23]表明，Zn2+可促進氧化應激損傷，但另一些報道[28-29]顯示，Zn2+具有抗氧化作用。許多含鋅蛋白或被鋅調節的蛋白能直接或間接影響細胞的氧化平衡。研究[28]表明，細胞氧化應激損傷與Zn2+下降相關聯，Zn2+濃度增加可阻止氧化應激損傷。缺少Zn2+的培養神經元和動物模型氧化信號激活，且通過下調細胞內的谷胱甘肽(glutathione, GSH)降低細胞對促氧化應激物質的承受能力[29]。

5 腦缺血再灌注后氧化應激對Zn2+的調控作用

腦缺血時顯著發生的氧化應激和酸中毒能夠誘導Zn2+從MT蛋白釋放，引起細胞內Zn2+增加，這種機制已經在培養神經元中得到證實，并可能是ZnT3敲除動物海馬錐體神經元內Zn2+增加的機制[30]。研究[31]顯示，大鼠在含氧量正常但血糖低的情況下，可以引發NO應激，最終引起Zn2+聚集。這可能是通過NMDAR介導的nNOS途徑實現的。這種NO依賴性的Zn2+增加可以激活NADPH氧化酶及PARP1，誘導細胞死亡。盡管自由基對鋅離子的調控作用已逐漸成為研究熱點，但目前有關這方面的研究還十分有限。探究氧化應激對鋅離子的調控，必將有助于揭示腦缺血損傷的機制。

綜上所述，在腦缺血再灌注損傷中，自由基與Zn2+之間存在相互作用，Zn2+可能通過線粒體或NADPH氧化酶等途徑促進ROS產生，ROS也可以促進Zn2+從MT等存儲位點釋放，兩者相互作用促進神經損傷。Zn2+在特定條件下又可以發揮抗氧化作用。但迄今為止，Zn2+促進氧化應激并產生損傷的分子機制還沒有完全闡明，ROS對Zn2+的調控作用及機制更是知之甚少。因此，腦缺血再灌注損傷中自由基與Zn2+的相互作用值得深入研究，這將為開發腦缺血損傷的保護措施提供新策略。

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