基因編碼鈣指示劑在藥物反應性細胞核鈣信號實時動態檢測中的應用

龔明濤 張晨光,2 丁 衛,2*

(1. 首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，北京 100069; 2.腫瘤侵襲和轉移機制研究北京市重點實驗室，首都醫科大學腫瘤研究所， 北京 100069)

鈣離子是真核細胞內最為重要的第二信使物質之一，參與調控多種細胞活動，如細胞的增生、分化、生長、凋亡以及基因轉錄和興奮性生理表型[1]。在神經元等可興奮細胞中，細胞對核內鈣離子濃度的變化十分敏感；并且細胞核鈣濃度的異常，與多種人類疾病，特別是神經系統疾病的關系密切。有研究[2-3]表明，在阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥以及帕金森病的發生和進展中均伴隨著細胞核鈣離子濃度在不同程度上的異常變化。近年來的研究[4]還陸續顯示，細胞核鈣離子還參與了對多種基因的表達調控過程，其中包括Atf3、Btg2、GADD45β、GADD45γ等一些重要的轉錄活化調控因子。

在活細胞水平對鈣離子的功能研究中，鈣指示劑是必不可少的工具。傳統用于檢測細胞質中鈣離子濃度的化學指示劑有Fura2和Fluo3等[5-6]。隨著基因工程技術的發展，新型的鈣離子指示劑——基因編碼鈣指示劑(genetically-encoded calcium indicators, GeCI)得到日益廣泛的應用，并且以其出色的表現和獨特的功能和優點受到研究者的青睞[7]。GeCI可以實現在體實驗中對鈣離子的長時程檢測和實時動態監測，并且還可以借助細胞器的特異性定位信號表征某些特定的亞細胞結構的鈣離子變化情況[7]。近幾年來對GeCI的不斷改進部分彌補了其相對于化學合成鈣指示劑靈敏度偏低的不足。Chen等[8]所研發的GCaMP6屬于較新一代GeCI中的一種，其檢測靈敏度有很大提升，并且在細胞內的表達更加穩定。Qi等[9]將核質蛋白(nucleoplasmin)的核定位序列(nuclear localization signal, NLS)以及一種紅色熒光蛋白(tdTomato)與GCaMP6s進行融合，構建出nuGCaMP6s-tdTomato重組質粒。經過細胞轉染后，tdTomato作為非鈣離子敏感的表達熒光基團，可作為校準的轉染效率和熒光漂白作用的內參分子。

在本研究中，筆者將重組質粒轉染到U87MG細胞和非興奮細胞HeLa細胞中，在青蒿素、過氧化氫以及Paxilline等藥物的作用下，核鈣離子均有明顯的增多。但不同的藥物作用以及在不同的細胞之間，其核鈣的變化情況有很大的區別。在腫瘤細胞中，異質性是其一個重要的標志，腫瘤細胞的異質性與腫瘤的耐藥性有著至關重要的關系[10]。并且已有研究[10]表明細胞內氧自由基(reductive oxidative species，ROS)水平的增高，對腫瘤細胞的異質性有很大的影響。在低濃度ROS情況下，ROS可能作為促進腫瘤異質性發生的重要信號分子[10]。深入研究腫瘤細胞的異質性，有助于分析和了解腫瘤產生的機制、演化規律，解釋腫瘤治療過程中出現不同適應性表型的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒和細胞

重組質粒nuGCaMP6s-tdTomato由首都醫科大學醫學遺傳與發育生物學系葉海虹教授饋贈。分子克隆的載體為pcDNA3.1真核細胞基因過表達質粒。HeLa人宮頸癌細胞和U87MG人惡性膠質母細胞瘤細胞均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。

1.1.2 主要試劑和藥物

新生牛血清購自美國Hyclone公司；DMEM培養基購自美國Corning公司；蕈青霉素(Paxilline)購自英國Tocris生物科學公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染

HeLa細胞和U87MG細胞置于含10%(體積分數)新生牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素的DMEM培養基。在37 ℃、5%(體積分數) CO2培養箱中培養，隔天給細胞更換新鮮DMEM完全培養基。HeLa細胞48 h傳代一次，U87MG細胞48～72 h傳代一次。

細胞生長到對數生長期時，將1.5×105個HeLa細胞或2.5×105個U87MG細胞鋪板于35 mm共聚焦顯微鏡專用培養皿中。鋪板18 h后的細胞換無FBS的DMEM培養基。將重組質粒nuGCaMP6s-tdTomato與Lipofectamine 2000TM和DMEM培養基混合，靜置20 min，加入到換液后的細胞中，6 h之后給細胞換新鮮DMEM完全培養基。

1.2.2 轉盤熒光共聚焦鈣成像

將轉染重組質粒nuGCaMP6s-tdTomato 24 h后的細胞，置于轉盤共聚焦顯微鏡(UltraVIEW VoX)下每間隔約25 s進行實時熒光圖像采集。在成像過程中完成基線數據記錄后，加入青蒿素(ART，100 ng/mL)等藥物刺激細胞，分別記錄核鈣成像信號和內參熒光信號(激發波長分別為488 nm與560 nm，檢測波長區間相應為490～550 nm與590～700 nm)。

1.2.3 熒光共聚焦鈣成像

HeLa細胞生長到對數生長期時，將細胞鋪板于放置有玻片的24孔板上。鋪板18 h后，細胞換無FBS的DMEM培養基，進行nuGCaMP6s-tdTomato質粒轉染。轉染24 h之后，向細胞中加入Hoechst進行細胞核染色，20 min后棄去Hoechst染液，PBS清洗3次，每次5 min。將玻片置于加有封片劑的載玻片上固定。室溫靜置1 h后將玻片置于STED超高分辨率共聚焦顯微鏡(TCS SP8 STED)下觀察[激發波長分別為488 nm與561 nm，檢測發射波長為(520±30)nm與(650±35)nm]。

1.2.4 數據分析

共聚焦鈣成像圖像使用Image J分析灰度值，再通過綠色熒光(GCaMP6s)與紅色熒光(tdTomato)的比值，繪制統計圖像。細胞核鈣的動態曲線通過自定制的EXCEL程序及其界面完成。將Image J取得的熒光灰度值置于Cluster V3.0軟件后，采用“complete linkage”選項的缺省參數進行聚類分析。根據聚類分析結果進行的細胞分類和統計過程采用K-mean算法由計算機程序自動完成。將所得的輸出文件導入JavaTreeView軟件中，根據可視化的顯示結果進行后續的細胞分組和異質性比較分析。

2 結果

2.1 重組質粒Nu-GCaMP6s-tdTomato轉染后熒光觀察

脂質體介導重組質粒nuGCaMP6s-tdTomato(圖1A)轉染到HeLa細胞中24 h之后，將4%(質量分數)多聚甲醛固定的細胞樣本玻片置于STED超高分辨率共聚焦顯微鏡下進行掃描成像(圖1B)。可見紅色熒光蛋白tdTomato在轉染細胞中表達并且特異定位在細胞核區域，與Hoechst染料復染的細胞核完全共定位；而GCaMP6s的熒光信號在未經刺激的細胞很弱，甚至低于可檢測水平，表明在正常培養條件下細胞核內的鈣離子濃度處于較低水平。將轉染重組質粒24 h后的未固定活細胞置于熒光共聚焦顯微鏡下進行觀察(圖1C)，在向共聚焦培養皿中加入Paxilline(10 μmol/L)后，可見HeLa細胞核內的GCaMP6s熒光信號顯著增強，且濃度隨著藥物作用時間的延長持續增加，而tdTomato的紅色熒光強度除激光漂白作用略有下降基本保持穩定。將GCaMP6s熒光強度與tdTomato熒光強度在去除基線本底信號后計算比值可用于細胞核鈣離子濃度的相對定量指示(圖1D)。

圖1 細胞核定位的GCaMP6s熒光信號經tdTomato標準化后用于核鈣水平的定量分析Fig.1 Fluorescence signal of nuclei-localized GCaMP6s used for quantitative analysis ofnuclear calcium level after normalization with tdTomato

A: plasmid map of nuGCaMP6s-tdTomato;B: confocal imaging of HeLa cells after nuGCaMP6s-tdTomato transfection;C: real-time fluorescence imaging of HeLa cells with Paxilline treatment after nuGCaMP6s-tdTomato transfection;D: quantitative analyse of fluorescence intensity ratio between GCaMP6s and tdTomato in the same cell;NLS:nuclear localization sequence.

2.2 細胞內在遺傳背景及外在環境刺激因素對核鈣信號的影響

在進一步的研究中，筆者首先利用Paxilline給藥作為細胞核鈣信號的刺激條件，將重組GeCI質粒分別轉染到HeLa細胞和U87MG細胞，以前述的規一化的綠色/紅色熒光強度比值為測量參數，觀察和比較了兩種細胞的反應性動態核鈣信號變化(圖2A、B)。結果顯示，在HeLa和U87MG細胞中均可檢測到在40 min記錄時程中細胞核鈣濃度的進行性增加，且增加的幅度相對比較接近，以HeLa細胞中的數值略高。然而，在兩種細胞中，核鈣增加的動力學模式則存在顯著的差別。在HeLa細胞組中，快速增加的時相從700 s起開始出現，呈漸進性；而在U87MG細胞中，核鈣的迅速增加從150 s左右已經開始，并且較快達到平臺峰值。表明細胞內在環境，即主要由遺傳背景所決定基因表達核穩態差異，能夠顯著影響細胞核鈣水平對外界刺激的反應性。

此外，為了探索一些具有生物活性的化合物是否能夠引起類似Paxilline的核鈣刺激反應，筆者在經過nuGCaMP6s-tdTomato轉染的HeLa細胞培養中，即時加入不同的藥物并觀測活細胞核鈣水平的動態變化。研究ART同樣能夠導致細胞核鈣的持續增加(圖2C)。在HeLa細胞中與Paxilline的作用有類似之處，存在約600 s的緩慢上升的滯后時段；但是增加的幅度較小，約為1/4左右。ART引起的核鈣變化與H2O2的作用明顯不同，其核鈣的反應性增加更為強烈且持續；而同時通過圖中所顯示較大的數據標準誤，可潛在提示出細胞對H2O2的刺激反應存在一定的異質性(圖2D)。為排除加藥或記錄等操作過程對細胞刺激所引起細胞核鈣變化的可能性，筆者使用了多種藥物的溶劑DMSO作為實驗對照，發現其對于細胞核鈣離子沒有明顯的影響(圖2E)。

圖2 細胞內在遺傳背景及外在環境刺激因素對核鈣信號的影響Fig.2 Effect of genetic background and external environmental stimuli on nuclear calcium signal

A: real time nuclear calcium signal profiles of HeLa cells treated with Paxilline(50 μmol/mL);B: real time nuclear calcium signal profiles of U87MG cell treated with Paxilline;C-E: real time nuclear calcium signal profiles of HeLa cell treated with ART(artemisinin) (100 μg/mL), H2O2(100 μmol/mL) and 10% DMSO.

2.3 U87MG細胞中核鈣水平的變化可反映對外界刺激應激反應表現的異質性

為進一步觀察細胞在受到應激刺激后是否具有異質性的反應，筆者在GeCI質粒轉染的U87MG細胞給予Paxilline核鈣激動之前，先期將其短期暴露于H2O2(100 μmol/L)中。在利用Image J軟件分析綠色紅色熒光灰度值并計算熒光比值的動態變化之后，將獲得的數據依次導入至Cluster V3.0和JavaTreeView軟件，進行U87MG細胞異質性表現的聚類統計。在圖3中可見，受到H2O2應激刺激后，U87MG細胞的表現大致被分為3類。可見大部分(68.2%)細胞的核鈣曲線與圖2中未經H2O2處理的情況較為類似，但核鈣離子的增加在初始時更為迅速。另分別有約13%和18%的細胞則表現出顯著不同特征，前者在后期出現鈣信號的變異較大，呈持續上升，后者在一過性的峰值過后，鈣離子濃度恢復至穩定的較低水平。

圖3 過氧化氫處理引發U87MG細胞Paxilline反應性核鈣變化的異質性表現Fig.3 Heterogeneity of nuclear calcium alteration in U87MG cells with sequential treatment of H2O2 and Paxilline

U87MG cells were first transfected with nuGCaMP6s-tdTomato, and 24 h later, were treated with H2O2(100 μmol/mL) for 5 minutes, followed with Paxilline(50 μmol/mL) stimulation. The dynamics of the nuclear calcium alteration were recorded.

3 討論

在興奮細胞的研究中，鈣離子及其多樣性的生物學研究一直受到較多的重視。近些年來，細胞核鈣濃度的變化逐漸引起人們的關注，并且已被證實與諸多的基因表達調控關系密切[11]，但是就總體而言，關于核鈣功能的研究仍然很不充分，而在非興奮性細胞研究中更為缺少[12]。傳統用于鈣離子研究的指示劑通常屬于化學合成的指示劑，如Fura2、Fluo3等，但是這些指示劑并不能滿足細胞核鈣研究的要求，在使用中常常受到許多胞質因素的干擾[11]。新型GeCI在許多領域的研究中優勢顯著，特別是以GCaMP6為基礎的改進型分子。GCaMP6分為GCaMP6f和GCaMP6s兩種，相較于GCaMP6f，GCaMP6s藥代動力學緩慢，在細胞內可以長時間存在，更加耐受熒光的激發漂白作用。本課題中為適應非興奮性細胞模型所使用的GCaMP6s指示劑，不僅檢測靈敏，而且由于NLS的存在，可以直接將指示劑定位到細胞核，基本上排除了胞質鈣離子等因素的干擾。再通過綠色熒光(GCaMP6s)和紅色熒光(tdTomato)的灰度比值，可以更準確和迅速地檢測細胞核內鈣離子的變化情況。

在本研究中，筆者構建了可用于細胞核鈣水平動態分析的鈣指示劑載體，并且建立和完善了相應的定量指標與技術流程。應用此方法不僅可以比較不同遺傳背景細胞系之間的核鈣調控差異性，而且可以快速簡便地篩選各種可引起細胞核鈣濃度改變的天然及合成化合物。據文獻[13-14]報道，青蒿素具有抗炎、抗癌以及改變細胞內包括酸堿度和其他多種代謝物豐度的生物學活性，參與其作用機制的信號途徑之一是PI3K相關的細胞鈣離子第二信使介導的轉錄激活效應。盡管ART能否直接引起細胞核鈣濃度的變化此前尚無報道，但鑒于細胞核鈣與細胞質鈣離子的水平變化往往呈現出一定的關聯性，本研究所發現的ART刺激后的核鈣離子濃度增加現象也并非完全意外的結果[15]。此外，本研究的結果還表明，核鈣對外界刺激的反應性的分析可以用于揭示細胞生命過程中存在的功能異質性。腫瘤細胞的異質性是惡性腫瘤的特征之一，細胞異質性的研究也是腫瘤研究中的一個重要領域[16]。在腫瘤生長過程中，經過多次分裂增生，細胞異質性可能在遺傳、環境和細胞內過程等許多層面參與腫瘤細胞表型的決定[17]，而對腫瘤細胞異質性的研究在癌細胞的擴散轉移機制研究、以及腫瘤的治療和預后方面有著重要的意義[16，18-19]。通過比較不同的細胞在相同藥物刺激下或某種細胞在不同的藥物刺激下核鈣離子變化的情況，可以作為細胞行為或細胞改變的最初功能性檢測指標；同時細胞在接受刺激后核鈣變化的異質性表現也可能成為細胞分類或分選的依據，這一不依賴于基因檢測的策略具有與其他組學分析方法所不同的快速、及時和動態特點，并且具有和組學研究互補結合的可能性，在實際應用中將會展示極大的潛力。例如，通過此方法進行大量藥物的篩選，可以幫助歸類藥物的適宜靶向細胞類型，提示藥物間作用機制的共性與差異，或者優化藥物作用劑量、組合或溶劑/劑型等。

關于細胞核鈣離子的來源問題，在神經元中被認為是從細胞雙層核膜中釋放進入胞核[20]。由于細胞核膜與內質網存在連通，因而可能更多受到內質網鈣濃度變化的影響。當細胞外鈣離子進入細胞時[21]，也有可能部分進入到細胞核，但其快速和脈沖式的動力學表現似乎與本研究中所見的核鈣緩慢且持續性的增加不甚一致。當然是否也存在內質網鈣釋放到胞質后，再進入到細胞核的情況，需要在一些特定的實驗模型中進行后續的探討。關于細胞核鈣的變化與細胞核膜以及內質網鈣離子的關系，在本研究所發現和描述的現象中得到實驗結果的支持，這也進一步提示了細胞在應激狀態下，特別是內質網應激出現時，細胞核鈣水平的改變對細胞基因表達的調控以及細胞穩態的維持可能具有重要的生理和病理意義。

盡管越來越多的研究[22]開始涉及核鈣離子對細胞的影響，但是關于核鈣離子生物學意義和作用機制的一些關鍵問題尚未解決。在神經細胞中，已有研究[23-25]表明鈣離子受到一些激酶和膜通道分子的調控，可以通過核孔復合物(nuclear pore complex, NPC)進入到細胞核。在非可興奮細胞中，核內鈣離子是否存在不同的調控機制或影響因素，并且如何影響甚至改變細胞的非興奮性表型，此類重要的科學問題的解決需要對細胞核鈣離子進行動態和細致的描述，本研究恰恰為此提供了幫助。但是本研究尚未能夠對細胞核鈣的動態曲線和描述參數提供確切的生物學意義詮釋，這是需要在今后的研究和應用中力圖解決的迫切問題。

此外，本研究所用的技術方法在今后的實驗室應用中還存在持續獲得優化和改良的空間，具體的改進可包括如下方面：1)延長觀測時程，如果能夠達到6 h以上則可以隨著部分基因轉錄和編碼蛋白表達的完成，得到更加豐富和具有提示意義的信息；2)考慮在提高系統穩定性的基礎上，嘗試藥物或刺激因素的組合，如此可使得本方法具有多種電生理實驗的特征，通過特異性激動劑或阻斷劑的聯合或組合使用，進行相關因素的解析或因果關系的研判；3)增加分析能力和通量，本研究具備單細胞分析的特征，可以與多種高內涵或微流控分析設備的軟硬件系統結合使用，同時所記錄的數據也能夠自然形成大數據分析中的一個特殊層面，成為與形態學和組學分析相互補的直接功能性指標。4)追蹤和保持與新型載體和熒光指示劑在實驗室應用中的及時更新，包括病毒載體和與在體實驗熒光檢測裝備結合應用的可能性，同時隨著更敏感的GeCI的研發和使用，本研究所創建的技術方法在核鈣信號研究中的推廣和應用將能夠取得更加令人矚目的結果和發現。

致謝：感謝首都醫科大學中醫藥學院仇峰博士提供本研究所使用的研究級青蒿素試劑。

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