高脂飼料中添加丙硫氧嘧啶對大鼠血脂、體質量及體脂的影響

郝維佳 楊秋實 李靜宜, 2 馬 毅 陸 莉 熊 杰 李宇航 徐平湘 陳 怡 薛 明 李曉蓉*

(1.首都醫科大學基礎醫學院藥理學系，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院 北京熱帶醫學研究所 熱帶病防治研究北京市重點實驗室，北京 100050)

高脂血癥是導致動脈粥樣硬化、腦卒中、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)、心肌梗死的獨立危險因素，也是促進高血壓、糖尿病、脂肪肝等的重要危險因素。多年來，高脂血癥病因、病理機制以及藥物開發始終是研究的熱點。而理想的高脂血癥動物模型是這些研究工作成功的基石，制備高脂血癥動物模型有多種方法，其中最常用的方法是使用提高了能量和脂質含量的高脂飼料，如加入植物油脂、動物油脂、膽固醇等，誘發動物高脂模型。此法簡單易行，成本低廉，對動物損傷小，應用非常廣泛。但是飲食誘發的高脂模型常常需要數月時間，制作周期長，且有時血脂升高程度不理想，因此在制作模型時研究者常會加入抗甲狀腺藥物——丙硫氧嘧啶作為工具藥，大幅度縮短成模時間和提高血脂濃度，因而添加丙硫氧嘧啶是常用的建模策略[1-2]。筆者曾對2011-2015年發表的使用高脂飼料的中文文獻進行了統計，其中使用丙硫氧嘧啶作為添加劑的文獻約占13%，說明國內使用這一方法的研究者較多[3]。但是作為抗甲狀腺藥，丙硫氧嘧啶協助升高血脂的同時帶來甲狀腺功能抑制的其他伴隨癥狀，例如體質量下降、體脂降低、體質下降以及脂質代謝酶活性改變等，可能對合理分析高脂血癥的病理機制，以及對調脂藥物的藥效和作用機制的評價產生影響，尤其是體質量、體脂等方面的影響非常容易被忽略，目前關于這方面的研究報道還比較少，本研究將系統探討丙硫氧嘧啶對飲食誘導的高脂模型大鼠的血脂及動物采食量、體質量和體脂的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠32只，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 實驗藥品和儀器

丙硫氧嘧啶(純度>99%)(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140326)。全自動生化分析儀(美國Dade Behring 公司)，光學顯微鏡(日本Olympus公司 BX41)，免疫分析儀(美國貝克曼公司DX1800)，萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，2D5-2A型低速離心機(北京醫用離心機廠)，Vortex-Genie2渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)。K-Viewer數字病理解決方案軟件(寧波江豐生物信息技術有限公司)。

1.3 動物分組及方法

所有動物適應性飼養2 d后，采用數字表法隨機分為4組[4]，分別為正常飼料組(control，Con)、正常飼料+丙硫氧嘧啶組(control+propylthiouracil，Con+PTU)、高脂飼料組(high fat diet，HFD)、高脂飼料+丙硫氧嘧啶組(high fat diet+propylthiouracil，HFD+PTU)。正常飼料為嚙齒類動物正常維持料，高脂飼料為基礎飼料中添加10%(質量分數)豬油、2%(質量分數)膽固醇、0.3%(質量分數)膽鹽構成。PTU劑量為 50 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次，連續4周。實驗過程中每日測量動物體質量，并記錄采食量，實驗結束日采用10%(質量分數)水合氯醛麻醉后準確測量大鼠從鼻尖至肛門的長度即體長，并根據公式Lee’s 指數=體質量(g)1/3×103/體長(cm)計算Lee’s 指數[5-7]，腹主動脈插管取血，靜置1 h，4 000 r/min，離心10 min，取血漿檢測血脂4項、血糖、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)，血漿三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、甲狀腺素(tetraiodothyrenine, T4)、游離T3(free T3, FT3)及游離T4(free T4, FT4)濃度，并且取肝臟、腎周脂肪和睪周脂肪，稱質量計算肝系數和脂肪系數，多聚甲醛固定肝臟和脂肪組織，肝臟進行HE和油紅O染色，脂肪組織進行HE染色[8]。Image J軟件測量脂肪細胞面積(400×)，每份標本測量10個視野[9-10]。

1.4 統計學方法

檢測數據采用SPSS 20.0軟件,應用析因設計方法對測量值進行分析，采用SPSS中的General Linear ModelUnivariate模塊進行分析。動物體質量和采食量數據采用重復測量數據的方差分析，使用SPSS中General Linear ModelRepeated Measurement模塊進行分析，兩兩比較用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠血脂的影響

高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠血脂的影響結果詳見表1，正常飼料組血漿總膽固醇(total cholesterol, TC)為(1.51±0.29)mmol/L，HFD和PTU均具有升高血漿TC的作用(P<0.01)，HFD與PTU合用后血漿TC濃度更進一步顯著升高，較單用HFD或PTU升高數倍，析因分析表明HFD和PTU之間的交互效應具有統計學意義(P<0.001)，結合數據表明HFD和PTU有協同升高TC的作用。低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)的變化趨勢與總膽固醇的變化趨勢一致，HFD和PTU均具有升高LDL-C濃度的作用，二者合用進一步顯著升高LDL-C濃度，HFD和PTU的交互效應具有統計學意義(P<0.001)，說明添加PTU可加強高脂飼料誘導升高血漿LDL-C濃度的作用。給予HFD后血漿高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C) 濃度下降(P<0.05)，此特點與臨床常見的高脂血癥中血脂變化特征相似，而給予PTU后血漿HDL-C濃度升高，這一特征與高脂飼料引起的變化趨勢不一致，造成動物模型中HDL-C濃度表現復雜多變，與臨床血脂變化常常不統一。各組之間的三酰甘油(triglycerides，TG)濃度差異無統計學意義。總之，從上述實驗數據可以看出，高脂飼料中添加PTU，可協同升高血漿中TC和LDL-C濃度，使動物造模速度和幅度均提高。

GroupTCTGHDL-CLDL-CCon1.51±0.29 0.46±0.111.28±0.29 0.19±0.05 Con+PTU2.46±0.40**0.35±0.111.87±0.12*0.95±0.20**HFD2.36±0.21**0.46±0.140.96±0.06*1.52±0.21**HFD+PTU18.00±8.88**##0.61±0.323.57±0.87**##15.87±8.96**## *P<0.05, **P<0.01 vs Con; ##P<0.01 vs HFD; PTU:propylthiouracil; HFD:high fat diet;TC:total cholester-ol;TG:triglycerides;HDL-C:high density lipoprotein-cholesterol;LDL-C:low density lipoprotein-cholesterol; Con:control.

2.2 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠血漿轉氨酶和血糖的影響

如表2所示，各組之間的ALT和AST濃度差異無統計學意義，單獨給予HFD或與PTU合用誘導1個月并沒有造成血漿轉氨酶濃度顯著升高，提示誘導1個月并未造成明顯的肝細胞損傷。血糖檢測結果表明，僅給予PTU組血糖濃度下降，而HFD和HFD+PTU組的血糖濃度與正常組相當。

GroupALT/(IU·L-1)AST/(IU·L-1)Glucose/(mmol·L-1)Con70.83±33.48139.77±81.4311.42±2.42Con+PTU47.17±13.0897.93±23.657.15±0.89**#HFD43.08±14.27215.77±118.4810.44±3.02HFD+PTU60.15±14.12100.47±55.5711.85±3.45 **P<0.01 vs Con;#P<0.05; PTU:propylthiouracil; HFD:high fat diet; ALT:alanine aminotransferase;AST:aspartate aminotransferase;Con:control.

2.3 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠甲狀腺功能的影響

從表3可看出，單獨給予HFD對血漿T3、T4、FT3、FT4濃度沒有影響，而PTU可使甲狀腺素濃度下降尤其是T3、T4濃度(P<0.01)，析因分析表明HFD和PTU之間無交互作用。

2.4 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠體質量及采食量的影響

對各組大鼠體質量數據應用重復測量數據方差分析顯示, 時間因素有統計學意義(P<0.001), 說明動物體質量有隨時間變化的趨勢；但時間和飼料的交互作用沒有統計學意義, 說明時間因素的作用不隨著飼料的不同而不同，時間和PTU分組的交互作用具有統計學意義(P<0.001), 說明時間因素的作用隨著是否加入PTU的不同而不同。組間變異計算結果顯示，HFD處理因素無統計學意義，PTU處理因素具有統計學意義(P<0.001)，提示PTU的有或無可造成動物體質量的不同。實驗的最初幾天動物體質量勻速上升，且各組體質量增長趨勢相同，大約到第10天左右時，動物體質量增長趨勢分化為含PTU和不含PTU兩類，不含PTU組動物體質量依然保持原有增長速度，含有PTU組動物體質量不再繼續增長，而是基本維持不變，繼而略有下降。在第10天時Con與Con+PTU組的體質量差異有統計學意義，第13天HFD與HFD+PTU組差異有統計學意義，這些差異越來越顯著，一直持續到實驗結束(圖1)。

GroupT3/(ng·dL-1)T4/(ng·mL-1)FT3/(pg·mL-1)FT4/(ng·dL-1)Con68.72±8.22 50.89±8.60 1.94±0.30 1.66±0.23 Con+PTU23.59±20.62**##18.04±4.14**##0.72±1.591.08±0.35HFD56.21±6.7845.23±7.281.83±0.171.29±0.17HFD+PTU15.58±10.07**##14.94±8.17**##0.12±0.29*#0.56±0.49** *P<0.05, **P<0.01 vs Con;#P<0.05, ##P<0.01 vs HFD; PTU:propylthiouracil; HFD:high fat di-et; T3:triiodothyronine;T4:tetraiodothyronine;FT3:free T3;FT4:free T4;Con:control.

圖1 丙硫氧嘧啶和高脂飼料對大鼠體質量的影響Fig.1 Effects of PTU and HFD on body weightof rats(n=8)

*P<0.05,Con+PTUvsCon;#P<0.05,HFD+PTUvsHFD；Con:control;PTU:propylthiouracil;HFD:high fat diet.

對采食量的分析表明，時間因素有統計學意義(P<0.001), 說明動物采食量有隨時間變化的趨勢；時間和飼料分組的交互作用(P<0.01)以及時間和PTU分組的交互作用(P<0.001)均具有統計學意義, 說明動物采食量隨時間的變化趨勢與是否使用高脂飼料和是否加入PTU的不同而不同。組間變異結果顯示，HFD和PTU處理因素的差異均具有統計學意義(P<0.001)，提示飼喂高脂飼料或加入PTU可對動物的采食量產生顯著影響。各組動物的采食量在最初5 d左右基本相同，圍繞20 g/d左右上下波動，Con組和Con+PTU在第5 d，HFD和HFD+PTU組于第8 d差異出現統計學意義(P<0.05)，含PTU的組動物采食量均低于相應不含PTU的實驗組。第6～30天，HFD組采食量低于Con組，第8～30天，HFD+PTU采食量低于Con+PTU組，高脂飼料為基礎的組的采食量低于不含高脂飼料組(圖2)。結合體質量和采食量結果可知采食量下降幾天后，體質量出現下降[11]。

圖2 丙硫氧嘧啶和高脂飼料對大鼠采食量的影響Fig.2 Effects of PTU and HFD on feed consumptionof rats(n=8)

*P<0.05,Con+PTUvsCon;#P<0.05,HFD+PTUvsHFD；Con:control;PTU:propylthiouracil;HFD:high fat diet.

2.5 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠Lee’s指數、肝系數及腎周脂肪和睪周脂肪的影響

各組之間Lee’s指數差異沒有統計學意義，但是含有PTU組的均數低于不含PTU組，析因分析表明，PTU主效應差異具有統計學意義(P<0.01)，HFD效應差異無統計學意義，二者之間也不存在交互效應(圖3A)。表明PTU可引起動物以體長為標準的體質量降低，動物消瘦。

以高脂飼料為基礎的兩個組的肝系數均比相應的兩個正常飼料組顯著升高，析因分析表明高脂飼料是影響肝系數的重要因素(P<0.01)。在正常飼料的基礎上加入PTU可使肝系數顯著降低，而在高脂飼料的基礎上加入PTU后肝系數顯著升高(圖3B)，此結果表明PTU本身并不造成肝系數升高或肝損傷，但是PTU與高脂飼料合用后，可加強高脂飼料提高肝系數造成肝損傷的作用。結合前文血脂的數據，可看出PTU與HFD合用后，協同升高血漿TC、LDL-C和肝系數，提高高脂飼料升高血脂及對肝臟造成的損傷。

對于脂肪組織的分析結果表明，對于脂肪組織，高脂飼料可顯著提高睪周脂肪系數(圖3C)，但是對腎周脂肪系數(圖3D)沒有升高作用。無論是正常飼料還是高脂飼料加入PTU后，腎周和睪周脂肪組織的重量均顯著減輕，析因分析結果也表明，PTU對腎周和睪周脂肪的影響具有統計學意義，是影響脂肪系數的重要因素(P<0.01)。

圖3 丙硫氧嘧啶和高脂飼料對大鼠Lee’s指數、肝系數及脂肪系數的影響Fig.3 Effects of PTU and HFD on the Lee’s index, liver index, adipose index of

**P<0.01;A：Lee’s index；B：liver index;C:epididymal adipose index;D: perirenal adipose index；Con:control;PTU:propylthiouracil;HFD:high fat diet.

2.6 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對高脂血癥大鼠肝組織病理學的影響

肝臟組織油紅O染色的病理檢查結果顯示：肝細胞核為藍色，脂滴為橘紅色。正常組肝索排列整齊，肝小葉結構正常，肝細胞以中央靜脈為中心單行排列成板狀結構，肝細胞形態、大小正常，胞質豐富，胞質內沒有橘紅色脂質顆粒(圖4A)。正常飼料+PTU組肝細胞形態略小，細胞內有少量脂質沉積，肝索結構正常(圖4B)。高脂飼料組肝細胞增大胞質內有大量紅染脂滴，部分肝索結構紊亂，局部肝細胞溶解壞死(圖4C)。高脂飼料+PTU組肝細胞內也有大量的脂質沉積，肝細胞點狀壞死(圖4D)。

2.7 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠脂肪細胞大小的影響

Image J測量脂肪細胞面積顯示，正常飼料組脂肪細胞飽滿，結構清晰，高脂飼料組的脂肪細胞面積比正常飼料組面積增大，但是差異無統計學意義，給予PTU后，脂肪細胞面積顯著小于相應的無PTU飼料組，即正常飼料+PTU<正常飼料組，高脂飼料+PTU<高脂飼料組，并且高脂飼料+PTU組>大于正常飼料+PTU組(P<0.01)(圖5A、B)。析因分析表明HFD和PTU對脂肪細胞面積的影響均具有統計學意義，兩因素間沒有交互作用，表明兩個因素均對脂肪細胞面積具有獨立顯著影響。

圖4 丙硫氧嘧啶和高脂飼料對大鼠肝臟組織病理學影響Fig.4 Effects of HFD and PTU on liver histopathological changes of rats (oil red staining, 200×)

**P<0.01;A：Con；B：Con+PTU；C：HFD；D：HFD+PTU；Con:control;HFD:high fat diet;PTU:propylthiouracil.

圖5 高脂飼料和丙硫氧嘧啶對大鼠脂肪細胞大小的影響Fig.5 Effects of HFD and PTU on adipocytes size of rats(HE staining, 400×)**P<0.01;Con:control; HFD:high fat diet; PTU:propylthiouracil.

3 討論

血脂異常在人群中很常見，可表現為高膽固醇血癥、高三酰甘油(triglyceride, TG)血癥、低HDL-C和混合型高脂血癥4種類型，其中以LDL-C升高為主要表現的高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化性心血管病的最重要危險因素，控制血漿總膽固醇和LDL-C是冠心病的一級預防和二級預防中的重要任務。數十年來，我國居民血脂異常的流行趨勢日趨嚴重，高膽固醇血癥發病率逐年上升，控制高膽固醇血癥的形勢還相當嚴峻，研究開發優秀的降血脂藥依然是藥理學工作者的重任。構建合適的高脂血癥動物模型是降脂研究的基石，應用提高膽固醇和飽和脂肪酸含量的高脂飼料誘發高脂血癥動物模型是最常用、最方便的方法，但是常規高脂飼料造模需要數月時間，周期較長，且血脂濃度升高程度有限，因此加入抗甲狀腺藥物加速造模和提高模型血脂濃度是常用策略，PTU是最常用的工具藥。本研究的結果也支持這個觀點，本研究中在給予SD大鼠高脂飼料的基礎上給予PTU能夠使血脂在1個月時就非常顯著地升高，大大提高了造模的速度和幅度。但是甲狀腺是體內重要的代謝調節激素，對糖、脂肪、蛋白質的代謝及交感、副交感神經均具有調節作用，因此抑制甲狀腺功能，會在升高血脂的同時帶來多種復雜影響，這些作用可能會干擾降脂藥物研究過程中藥效和作用機制的評價，需要慎重權衡。

首先，抑制甲狀腺功能除了影響脂質代謝外還可影響蛋白質和糖的代謝，因此加入PTU實際上是制作了一個復雜代謝障礙的模型，并非是一個單純的高膽固醇血癥模型。單純高脂飼料誘發的高脂血癥模型中血脂四項及血糖常常表現為升高[12-14]，加入PTU后血脂的變化以TC和LDL-C升高為主，TG濃度變化小，并且血糖升高不明顯甚至表現為下降[15]，這些變化特征與單純高脂飼料引起的血脂變化特征不完全一致，且和臨床常見飲食相關的高脂血癥患者的血脂譜表現形式也不一致，此模型適于進行高膽固醇血癥的研究，不適用于高TG或混合型高脂血癥的研究。而且甲狀腺功能降低或抑制還和多種對高血脂、高血壓、心血管病不利因素有關，如炎性反應、舒張期高血壓、高同型半胱氨酸血癥、止血異常、腎功能改變、非酒精性脂肪肝、胰島素抵抗、代謝綜合征等[16-19]。

其次，添加PTU在降低代謝率的同時可顯著抑制動物食欲，從而引起采食量顯著下降，繼之體質量持續下降，動物逐漸消瘦、活動減少、毛色發黃干枯、精神不振、對外界刺激反應性下降，本研究中HFD+PTU組的動物采食量、體質量、腎周脂肪、睪周脂肪、Lee’s指數等均低于單純使用HFD組，并且統計學結果表明針對這些指標，PTU作用具有統計學意義。這些現象總體呈現為血漿膽固醇持續升高，肝臟脂質蓄積，而體脂卻持續減少，動物一般情況下降的特征，這與臨床高脂血癥的特征也不一致，因而在研究中需要慎重權衡。

另外，抑制甲狀腺功能還能夠影響體內多種代謝脂質的酶和轉運體的活性，甲狀腺功能下降時，膽汁酸合成的限速酶7a羥化酶活性下降最快、最明顯[20]，而肝臟、成纖維細胞和其他組織中LDL-C受體的表達明顯降低，肝臟攝取LDL-C減少[21-22]。甲狀腺功能減退癥時促甲狀腺激素(thyrotropin，thyroid stimulating hormone，TSH)濃度升高可提高HMG-CoA還原酶活性，加速膽固醇合成[23]，而TSH濃度升高還可提高ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)表達，從而加速膽固醇外排過程[24]，加速膽固醇從血管內皮、平滑肌等外周細胞轉移至HDL-C。將膽固醇酯從HDL-C轉移到LDL-C和VLDL-C的膽固醇酯轉移蛋白(cholesterol ester transfer protein, CETP)的活性下降[25]，抑制了HDL-C和LDL-C、VLDL-C之間的膽固醇酯交換過程，肝脂肪酶和脂蛋白脂肪酶活性下降，抑制脂蛋白中富含TG的脂蛋白的降解和TG從這些脂蛋白轉移到HDL-C的速度[26]，有研究[27]表明甲狀腺激素可提高肝臟HDL-C受體即B類I型清道夫受體(scavenger receptor class-B, type I，SR-BI)的表達，這些過程不利于HDL-C循環利用。因此甲狀腺功能減退時表現為膽固醇合成增加、代謝減少、細胞外排膽固醇過程加強，而肝臟攝取膽固醇能力下降，這些變化共同造成血漿膽固醇濃度升高。因而抗甲狀腺藥物雖然是很好的高脂血癥造模工具藥，但是進行降脂藥物作用機制研究時，它們對多種脂質代謝酶的影響會嚴重干擾研究者對藥物作用機制和作用靶點的分析判斷。因此這種模型適用于藥物開發臨床前研究階段藥物降脂療效的篩選或初步評價，而不適用于藥物作用靶點和作用機制的深入探討。總之決定是否添加PTU需要根據研究目的和研究方案慎重考慮。

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