17β羥基類固醇脫氫酶5型和6型基因多態性與多囊卵巢綜合征發病風險相關性的Meta分析

李青春 邢瑩瑩 賈萌萌 程曉琳 田曉予

(河南科技大學臨床醫學院 河南科技大學第一附屬醫院婦產科，河南洛陽 471003)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS) 是一種以雄激素過高的臨床或生物化學表現、稀發排卵或無排卵、卵巢多囊改變為特征的病變[1]。流行病學研究[2]顯示，該病在育齡期女性中的發生率為6.1%～15.7%，占無排卵性不孕癥的80%[3]。PCOS以無排卵、不孕和肥胖、多毛等高雄激素血癥的典型臨床表現為主，該病不僅增加流產、早產、妊娠期糖尿病和高血壓疾病等產科疾病的發病風險，其遠期合并癥如糖尿病、代謝綜合征、心血管病、子宮內膜癌及患者生活質量問題等的發生風險也高于正常人群[1]。近年來，隨著生活環境的改變，其發病率呈上升趨勢，嚴重困擾人們的生活，得到社會各界的重視[4]。

迄今為止，PCOS的確切病因及病理生理機制仍不清楚。PCOS的家族聚集現象提示遺傳因素在其發病機制中起重要作用[5]。高雄激素血癥作為PCOS的主要特征，據報道[6]50%以上的PCOS患者存在高雄激素血癥，卵泡內雄激素過多可致卵泡閉鎖，從而使卵巢呈多囊樣改變。17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenases，17β-HSDs)參與雄激素生物合成及代謝，因此，編碼17β-HSDs的基因成為PCOS病因研究中的重要候選基因。目前有關17β-羥基類固醇脫氫酶基因(17β-hydroxysteroid dehydrogenase gene,HSD17B)的單核苷酸基因多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與PCOS發病相關性的研究報道結論并不一致。本文研究旨在選擇HSD17B的兩個亞型5型(HSD17B5rs3763676)和6型(HSD17B6rs898611)的SNP通過Meta分析的方法來探究各研究之間的不一致性，客觀評價HSD17B基因作為PCOS候選基因的可能性，為從基因水平上認識PCOS的病因及發病機制提供證據。

1 資料與方法

1.1 納入標準

本研究為病例-對照研究。PCOS病例組診斷符合歐洲人類生殖及胚胎學會和美國生殖醫學會制定的鹿特丹(Rotterdam)標準或者美國國立衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)制定的 NIH診斷標準，對照組為健康人群，且有兩組人群的基本構成信息。暴露因素為HSD17B5rs3763676或HSD17B6rs898611基因突變。結局指標為PCOS發病風險。文獻語種不限

1.2 排除標準

樣本資料交代不清或不全、數據不完整的文獻。對于重復報告的文獻，只納入最新發表或高質量者。剔除摘要、講座或綜述類文獻。

1.3 文獻檢索

通過計算機檢索中國知網、萬方、維普、中國生物醫學數據庫4個中文數據庫和The Cochrane Library、PubMed、EMBASE(OVID)3個英文數據庫，收集有關國內外發表的關于HSD17B單核苷酸多態性與 PCOS 關聯性研究的文獻，同時追溯納入文獻的參考文獻。檢索時限均為從建庫到 2017年6月30日。采用主題詞加自由詞的方法進行檢索，中文檢索主題詞包括“多囊卵巢綜合征、基因多態性、17β-羥基類固醇脫氫酶和17β-HSD”，英文檢索主題詞包括“Polycystic ovary syndrome”、“17beta-hydroxysteroid dehydrogenase”、“Polymorphism*”。

1.4 文獻篩選、資料提取及偏倚風險評估

兩名研究者嚴格按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料。提取的資料內容如下：第一作者、發表時間、種族、樣本量、PCOS的診斷標準、基因型的檢測方法、各組等位基因和基因型分布頻率。首先，對對照組進行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗以減少病例-對照研究中出現的抽樣偏倚，本文HWE檢驗應用Excel表格設置函數進行檢驗，當P>0.05時表示樣本具有群體代表性，來自同一孟德爾群體，符合群體基因遺傳平衡，可以進行Meta定量分析；當P≤0.05時，只進行描述性定性分析。然后，采用觀察性研究的偏倚風險評價工具紐卡斯爾-渥太華量表(Newcastle-Ottawa Scale，NOS)評價納入的病例對照研究的偏倚風險，NOS評分總分為 9 分，≥ 6 分的為高質量研究[7-8]。最后，將結果進行核對，對選評文獻過程中存在的分歧通過討論解決。

1.5 統計學方法

應用RevMan5.3軟件進行Meta分析，計算等位基因及各基因型遺傳模型的發病風險比值比(odds ratio，OR)及其 95%可信區間(confidence interval,CI)衡量。采用Q檢驗法研究各試驗間的異質性，并利用I2值對異質性進行定量分析。當P≥0.1和I2≤50%，表示研究間異質性較小，選用固定效應模型；反之，當P<0.1和I2>50%，表示研究間存在異質性較大，選用隨機效應模型。但是考慮到隨機模型相對較保守，使結果更傾于安全，對于I2≥30%，選擇采用隨機效應模型進一步驗證。如異質性源于低質量研究則進行敏感性分析。采用Z檢驗對合并效應量OR值進行假設檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。同時應用RevMan5.3軟件繪制漏斗圖分析可能存在的發表偏倚。

2 結果

2.1 文獻檢索結果

根據文獻檢索策略初步檢索得到相關文獻664篇：其中Pubmed 66篇，EMbase 36篇，The Cochrane Library 20篇，中國知網203篇，萬方209篇，中國生物醫學文獻37篇，維普93篇，利用Endnote X7文獻管理軟件去除重復文獻262篇。根據納入及排除標準，首先閱讀標題和摘要進行初篩，共剔除文獻390篇。然后閱讀全文進—步篩選，剔除符合排除標準的文獻共4篇，其中重復發表的研究1篇，綜述研究1篇，不包含HSD17B5rs3763676或HSD17B6rs898611基因位點的文獻2篇。在所有納入的8篇文獻中，1篇文獻研究結果顯示納入人群的HSD17B5rs3763676突變基因稀有，無法進行統計學分析，只能進行定性描述。具體文獻檢索流程見圖1。

圖1 文獻檢索流程圖Fig.1 Flow-chart of study selection

2.2 納入文獻的基本特征

本研究按照納入與排除標準共納入8篇文獻[9-16]，其中Ke等[15]和 Ju等[16]同時研究了HSD17B5和HSD17B6兩個亞型單核苷酸基因多態性與PCOS發病風險的相關性，但Ju等[16]研究的HSD17B5型中并不包括本研究rs3763676位點的突變基因多態性，所以最終共有5篇研究HSD17B5rs3763676位點單核苷酸基因多態性，包括病例組889例和對照組751例。但因柯紀定等[11]和Ke等[15]兩個研究發現中國人的G突變基因為稀有基因，無法進行HWE檢驗和Meta定量分析，只能進行定性分析。有關HSD17B6rs898611位點基因多態性與PCOS發病風險的研究共4篇進行Meta分析，共包括病例組 1 065例和對照組942例。納入文獻的基本特征見表1，納入研究的等位基因及基因型頻率分布情況及HWE檢驗結果見表2、表3。

表1 納入文獻的基本特征Tab.1 Characteristics of the included studies

表2 HSD17B5 SNP rs3763676 A→G及基因型頻率分布情況及HWE檢驗結果Tab.2 Allele and genotype HSD17B5 SNP rs3763676 A→G frequency distribution of the genes and HWE test results

表3 HSD17B6 SNP rs898611 T→C及基因型頻率分布情況及HWE檢驗結果Tab.3 Allele and genotype HSD17B6 SNP rs898611 T→C frequency distribution of the genes and HWE test results

2.3 納人研究的方法學質量

納入Meta分析的7篇文獻NOS評分≥6，表明納入的文獻質量較高(表4)。7個病例-對照研究中全部對病例組進行了充分定義而且具有代表性，幾乎都對對照組的選擇進行了詳細報道。大部分納入文獻都對各研究中病例組及對照組的年齡、體質量、月經初潮、代謝相關指標等混雜因素進行比較，但有些研究中這些因素兩組之間存在差異，而且大多數研究結果的比較并未調整這些混雜因素。大多數研究未報道測量是否采用盲法，但所有研究中病例組與對照組暴露因素的測量方法是完全相同的且應答率100%。

2.4 Meta分析結果

2.4.1HSD17B5rs3763676位點SNP與PCOS的發病風險相關性研究

本研究共納入3個病例對照研究進行Meta分析，所有異質性檢驗I2<50%，表明各研究間同質性較好。HSD17B5rs3763676A/GSNP的等位基因模型(GvsA)及基因型模型(顯性模型GG+AGvsAA，隱性模型GGvsAG+AA，共顯性模型GGvsAA及AGvsAA)間的差異均無統計學意義(表5，GvsA：OR=1.21，95%CI:0.98～1.49，P=0.070；GG+AGvsAA：OR=1.26，95%CI:0.85～1.86，P=0.250；GGvsAG+AA：OR=1.35，95%CI:0.86～2.12，P=0.190；GGvsAA：OR=1.47，95%CI:0.91～2.38，P=0.110；AGvsAA：OR=1.19，95%CI:0.79～1.78，P=0.410)。Qin等[9]的研究對象為混合人群，包括高加索人、非洲裔美國人、西班牙人和亞洲人，對高加索人群進行亞組分析時，發現所得結果與總體一致，等位基因模型和基因型模型均與PCOS發病風險差異無統計學意義(圖2)。

表4 納入文獻質量評價結果Tab.4 Assessment of quality results of the included studies

表5 5種遺傳學模型比較結果匯總Tab.5 Summary of the results of five genetic models

2.4.2HSD17B6rs898611位點單核苷酸基因多態性與PCOS發病風險的相關性研究

本研究共納入4篇HSD17B6rs898611 C/T SNP與PCOS發病風險相關性的病例對照研究進行Meta分析，研究結果表明除共顯性模型CCvsTT差異有統計學意義外(CCvsTT：OR=1.46，95%CI:1.02～2.09，P=0.040)，其余差異均無統計學意義(CvsT：OR=1.13，95%CI:0.96～1.32，P=0.140；CC+CTvsTT：OR=1.06，95%CI:0.88～1.27，P=0.570；CCvsCT+TT：OR=1.48，95%CI:0.95～2.29，P=0.080；CTvsTT：OR=0.99，95%CI:0.81～1.21，P=0.950，表5)。按研究對象種族分為中國漢族人和歐洲高加索人進行亞組分析，結果發現漢族人和高加索人的rs898611等位基因模型與各基因型模型均與PCOS發病風險差異無統計學意義(圖3)。

2.5 敏感性分析結果

本文采取逐一排除所納入Meta分析文獻的方法進行敏感性分析，通過Revman5.3軟件在每個效應模型分析中每次分別勾掉一個研究，觀察總效應量OR及95%CI和異質性檢驗結果(I2和P值)。敏感度分析結果顯示排除任意一項研究后，在相應的效應模型中每組OR值、可信區間及異質性結果均與總體接近，不受單個研究的影響，本Meta分析結果穩定性好，結果可靠。

圖2 高加索人HSD17B5 rs3763676與PCOS易感性的等位基因模型森林圖Fig.2 Forest plot of allele model of Caucasian HSD17B5 rs3763676

圖3 HSD17B6 rs898611與PCOS易感性的亞組分層等位基因模型森林圖Fig.3 Race subgroup analysis forest plot of HSD17B6 rs898611 allele model

2.6 發表偏倚評估

利用Revman 5.3 對HSD17B5rs3763676和HSD17B6rs898611的易感相關性的5種遺傳學模型繪制漏斗圖定性分析發表偏倚，所有模型的漏斗圖基本對稱，結果均提示沒有明顯的發表偏倚，結論可信度較高。

3 討論

17β-HSDs是一類NAD(P)H/NAD(P)+依賴的氧化還原酶，其主要功能是參與性激素的代謝，通過調節細胞內甾體類激素水平從而在生殖系統中發揮重要作用[18]。PCOS患者的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)激動劑試驗數據證實PCOS卵巢17β-HSD 表達增多[19]。卵泡膜細胞雄激素生成過多是PCOS發病的內在性質[20]，參與雄激素生物合成的關鍵酶量、活性及其基因表達水平一直是PCOS發病機制研究的熱點。17β-HSD5和17β-HSD6是17β-HSDs的兩個亞型，均參與雄激素合成代謝，17β-HSD5的功能是催化雄烯二酮轉化睪酮[21]，17β-HSD6通過催化高效的雄激素生成(如3α雄烯二醇向5α雙氫睪酮轉化)在調節能與雄激素受體結合的活性雄激素的平衡過程中起著重要的作用[22]，并有研究[23]表明PCOS卵巢卵泡膜細胞中HSD17B6的mRNA表達顯著增加。目前已有大量關于人17β-HSDs基因單核苷酸多態性與PCOS易感性關聯的研究發表，但各研究間的結論并不一致，總體看來缺乏較大量的樣本依據，所以本研究通過全面收集有關17β-HSDs單核苷酸基因多態性與PCOS發病風險相關性的研究，利用科學嚴謹的系統評價研究方法得出一個綜合可靠的結論。

本次研究結果表明，納入3篇關于HSD17B5rs3763676的5個不同的等位基因模型和基因型模型之間的比較差異均無統計學意義(P>0.05)，表明HSD17B5rs3763676G/A的突變與PCOS發病風險沒有相關性。筆者進一步只對高加索人進行亞組分析，所得結果與總體一致，表明高加索人的PCOS發病風險與HSD17B5rs3763676G/A的突變也沒有相關性。17β-HSD5參與卵巢雄激素生成，研究已表明HSD17B5rs3763676、rs12529和rs1937845基因多態性與PCOS血清睪酮高水平相關[9,13,16]，但是Nelson等[24]卵泡膜細胞培養試驗表明PCOS的17β-HSD5酶的活性及mRNA表達水平與正常人卵泡膜細胞并沒有明顯差異。本研究嚴格按Meta分析過程進行的，其HSD17B5rs3763676G/A的突變與PCOS發病風險沒有相關性的結論真實可信，但是HSD17B5基因多態性與PCOS高雄激素血癥相關的確切分子機制需進一步研究。

本研究結論與Qin等[9]的研究結果并不一致，可能與群體分層有關。群體分層是指在一個研究中不同群體在同一個疾病中具有不同等位基因頻率及基因型。群體分層對遺傳關聯分析可能直接導致結果偏倚，產生假陽性或假陰性的結果[25]。Qin等[9]研究納入的是混合人群，包括高加索人、非洲裔美國人、西班牙人和亞洲人，由于這些人群的遺傳背景不同而產生了假陽性結果。柯紀定等[11]和Ke等[15]對中國漢族人的rs3763676G/A的基因多態性與PCOS發病風險相關性進行了研究，結果發現G等位基因在中國人種中是一種稀有基因。柯紀定等[11]納入的121名研究對象中只有一位PCOS患者的基因型為AG，Ke等[15]納入的505名研究對象也是只有一位PCOS患者的基因型為AG，該結果也說明HSD17B5rs3763676G/A基因突變可能與PCOS發病風險沒有相關性，同時也表明在不同人種中rs3763676G/A具有不同的分布頻率，但是目前尚缺少其他種族有關HSD17B5rs3763676G/A基因與PCOS相關性的研究。

本研究納入4篇有關HSD17B6 rs898611C/T單核苷酸基因多態性與PCOS發病風險相關性研究，除共顯性模型CCvsTT比較的差異有統計學意義外(CCvsTT：OR=1.46，95%CI:1.02～2.09，P=0.040)，其余差異均無統計學意義。在進行種族亞組分析時，發現無論是漢族人還是高加索人，5種遺傳模型的差異均無統計學意義，表明HSD17B6rs898611C/T單核苷酸基因多態性與PCOS發病風險沒有相關性。雖然PCOS卵巢組織中HSD17B6酶的活性及mRNA表達增高，但是酶活性及基因表達改變的機制仍不清楚[23]。Jones等[10]首次對澳大利亞人進行了6個HSD17B6基因單核苷酸多態(rs2277339、rs7967600、rs898611、rs1227117、rs10459246、rs1870673)與PCOS之間相關性的研究，結果只有rs898611的等位基因在PCOS組和對照組之間存在明顯差異。Jones等[14]隨后對美國人進行研究驗證HSD17B6rs898611C/T與PCOS之間的關系，結果并未發現兩者之間存在相關性。Ke等[15]和Ju等[16]對中國漢族人的研究也沒有發現rs898611和PCOS之間存在相關性。所以本研究結果與大部分已發表的文獻觀點一致。

但是上述研究均表明rs898611基因多態性與PCOS代謝表型之間具有相關性，主要是肥胖和胰島素相關特征。已有研究表明卵巢局部高雄激素可以導致肥胖，胰島素與LH的共同作用可導致卵泡膜細胞和間質細胞過度增生合成更多的雄激素[26]。PCOS高雄激素血癥和胰島素抵抗之間具有相互作用，但是關于HSD17B6是如何影響循環胰島素水平的機制并不清楚，需要功能學研究進一步闡明PCOS雄激素代謝與胰島素代謝之間通路的具體機制。

近年來，大規模的遺傳學及功能學研究更進一步了解PCOS的病因及發病機制，特別是全基因組關聯研究(genome-wide association study,GWAS)，表明遺傳因素在PCOS具有重要作用[27-29]。但是PCOS不是一種單基因遺傳疾病，其致病原因是多基因共同作用的結果，同時環境因素和個人生活方式等因素也發揮重要作用。對于多基因遺傳病，即復雜性狀遺傳病，其遺傳并不完全符合孟德爾規律[27]。本研究僅僅分析了HSD17B5rs3763676和HSD17B6rs898611兩個單核苷酸多態性與PCOS的相關性，目前尚缺少其基因內部多個變異之間相互作用共同導致PCOS發病的多基因相關性研究。也許是HSD17B5rs3763676G/A或HSD17B6rs898611C/T單個基因變異對PCOS疾病的影響作用非常微小無法檢測出來得出不相關結論。

需要指出的是，本研究存在一定的局限性。首先，相關研究數量較少，Meta分析只納入3篇有關HSD17B5rs3763676G/A和4篇HSD17B6rs898611C/T的研究，而且筆者檢索雖然沒有限制語言，但納入的只有漢語和英語研究，可能存在未發表或其他的與本文相關的研究，這些研究均影響本研究的結果。其次，由于缺乏原始研究數據，無法在分析過程中對基因-基因或者基因-環境之間的潛在相互作用進行評估。最后，盡管所有研究的病例組和對照組都是按照篩選標準進行確定，但是還存在其他的潛在因素沒有被考慮。

綜上所述，該Meta分析雖然未發現HSD17B5rs3763676G/A和HSD17B6rs898611C/T單核苷酸基因多態性與PCOS發病風險存在關聯，特別是亞洲人 群，但HSD17B5和HSD17B6 這兩種酶對雄激素代謝存在影響，而雄激素在PCOS患病發揮重要作用。由于該Meta分析相應的局限性，因而不應忽視其與PCOS易感潛在的關聯，同時上述位點的具體功能尚未研究透徹，在上述結果得到合理的解釋之前，還需要進行大量關于上述位點功能的基礎研究。

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