青藤堿對骨質疏松性壓縮骨折家兔血清白細胞介素-1β及白細胞介素-17和骨生長分化因子2的影響

胡熙耀，萬 超，許明軍，劉敏娟，陳德森

(1. 湖北省十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬醫院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000)

骨質疏松屬內鈣調節激素分泌失調的全身代謝性疾病，尤以50歲以上的絕經婦女為嚴重，患者因鈣、磷、維生素及蛋白質等攝入不足，成骨和破骨代謝失衡，骨量減少、骨微結構改變、骨強度下降且脆性增加，在外力的作用下較易發生壓縮骨折，嚴重影響患者生存質量[1-2]。在骨折愈合過程中，炎性因子白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-17等常影響骨折局部微環境。IL-1β在誘導軟骨細胞凋亡的同時，還會誘導產生IL-17，降解軟骨細胞基質，降低成骨細胞活性，延緩骨痂形成[3]。而IL-17由活化的T 細胞產生，可增強破骨細胞活性并最終導致骨侵蝕[4]。骨生長分化因子2 (GDF2)具有誘導成骨分化和骨形成能力，可促進骨痂形成，在骨折愈合過程中扮演重要角色[5]。 中藥治療骨質疏松及骨折有獨特的療效，其中青藤堿是從青風藤的干燥根莖中提取的生物堿，具有鎮痛、免疫抑制、抗炎、抗風濕及抗腫瘤等作用[6]。其常用制劑有青藤堿緩釋膠囊、鹽酸青藤堿注射液等，臨床常用于治療風濕、類風濕、骨性關節炎、骨質疏松及骨折等疾病[7]。本研究旨在通過觀察青藤堿對骨質疏松性壓縮骨折家兔血清IL-1β、IL-17和骨折處骨痂組織中GDF2的影響，探討其作用機制，為其臨床應用提供更多理論依據。

1 實驗資料

1.1實驗動物 SPF級雌性家兔36只，7月齡左右，體質量(3.5±0.5)kg，由十堰市太和醫院實驗動物中心提供，合格證號：4200593344。

1.2試劑及藥品 水合氯醛(揚州市奧鑫助劑廠，批號： 015102913)，鹽酸青藤堿腸溶片(煙臺魯銀藥業有限公司生產，批號： 2016122603)；IL-1β、IL-17和GDF2檢測用ELISA試劑盒均由上海信則生物科技有限公司提供。

1.3模型建立方法 家兔適應性喂養1周后，用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內注射麻醉，俯臥位固定，剃毛，于家兔髂嵴頂部上方和腰椎骶棘肌兩側采用雙切口方法切開家兔背肌，分離出腹腔脂肪團中包埋的卵巢和子宮角。先結扎子宮角上部，然后摘除卵巢，摘除干凈后回納脂肪團，分層縫合背肌和皮膚，用雙氧水消毒。術后肌肉注射地塞米松(1 mg/kg)，2 次/周，共4周[8]。術后自由攝食、飲水，在20～22 ℃、相對濕度40%～70%的條件下飼養。 4周后再參照張淑嫻等[9]方法建立骨質疏松性壓縮骨折模型，即用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內注射麻醉，雙氧水消毒，切開兔L1-5皮膚，分離背闊肌、棘間肌及韌帶，從椎體側前方剪斷L1-5椎體前緣，術后椎體不做內固定，2周內強迫活動(6 h/d，因家兔的前肢不發達，后肢及脊柱背側肌群、腹側肌群比較發達，且生活體位多以半直立屈曲位為主，負重集中在后肢，動物清醒后，其覓食活動、強迫運動均會使椎體受壓，脊柱在此負重狀態下最終會出現壓縮狀態而形成骨質疏松性壓縮骨折[10])。在術后2周時拍攝骨痂X射線片，發現椎體有明顯壓縮變短等病理改變為建模成功。將建模成功兔隨機分為模型組、青藤堿A組、青藤堿B組，每組12只。

1.4干預方法 在骨質疏松性壓縮骨折建模成功后，青藤堿A組和青藤堿B組用事先配制好的10%鹽酸青藤堿腸溶片混懸液分別按每只家兔2 mL/(kg·d)和4 mL/(kg·d)的劑量灌胃，模型組按2 mL/(kg·d)劑量灌胃生理鹽水，3組均1次/d，連續灌胃1個月。

1.5觀察指標

1.5.1骨痂總評分 分別于灌胃10，20，30 d拍攝骨痂 X射線片，對骨痂生長情況進行評分。評分標準：斷端邊緣銳利整齊為0分，邊緣模糊為1分，接近消失為2分，全部消失為3分；骨痂密度顯示非常淡為0分，較淡為1分，較深為2分，非常深為3分；骨痂量無為0分，少量骨痂為1分，較多骨痂為2分，填滿為3分。以上3項評分相加為骨痂總評分，分值越高說明愈合越好。

1.5.2血清IL-1β及IL-17水平 分別于灌胃前后取耳緣靜脈血0.1 mL，采用雙抗體夾心法檢測血清IL-1β、IL-17水平。

1.5.3骨痂組織中GDF2表達情況 取血后處死家兔，剔取骨折處的骨痂組織，每組隨機取6只兔的骨痂組織研磨后3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測GDF2表達水平。

1.5.4骨痂組織中GDF2 mRNA表達情況 采用半定量RT-PCR 法檢測。取剩余兔的骨痂組織，提取GDF2總RNA，反轉錄至cDNA，用GAPDH作為內參，PCR擴增，然后進行半定量分析。GDF2上游引物：5’-ACCGACTAAGCGTACTCTCGC-3’，下游引物：5’-GCAATCACATGCTCACGTCAG-3。 GAPDH上游引物：5’-GCATCCTAAGTACGGATGCCGTAC-3，下游引物：5’-GCACCTACTCCAAGATAGTAC-3。PCR 反應條件：95 ℃ 2 min 變性， 95 ℃、52 ℃ 30 s，72 ℃30 s，擴增40個循環。檢測時根據標準曲線得出GDF2的分子拷貝數，用GAPD H的拷貝數作為基數進行校正，以目的基因拷貝數/GAPDH拷貝數之比值表示GDF2 mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1各組兔骨痂生長評分比較 灌胃10 d后，X射線片顯示3組均有少量骨痂生長，但3組綜合評分均較低，且3組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。灌胃20 d和30 d后，青藤堿A組和青藤堿B組骨痂生長良好，斷層邊緣逐漸模糊或消失，骨密度大，綜合評分均明顯高于灌胃10 d和模型組(P均<0.05)，但青藤堿A組和青藤堿B組綜合評分比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表 1。

表1 各組兔骨痂生長評分比較分)

注：①灌胃10 d比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組兔血清IL-1、IL-17水平比較 灌胃前，3組血清IL-1β、IL-17水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。灌胃結束后，模型組血清IL-1β、IL-17水平無明顯變化(P均>0.05)；青藤堿A組和青藤堿B組血清IL-1β、IL-17均明顯低于灌胃前及模型組(P均<0.05)，但青藤堿A組和青藤堿B組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組兔灌胃前后血清IL-1、IL-17水平比較

注：①與灌胃前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組兔骨痂組織中GDF2和GDF2 mRNA表達情況 灌胃結束后，青藤堿A組和青藤堿B組GDF2和GDF2 mRNA表達水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，但青藤堿A組和青藤堿B組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組兔骨痂組織中GDF2和GDF2 mRNA表達情況

注：①與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

IL-1β和IL-17作為炎癥因子，參與機體的炎癥反應。其中IL-1β是一種較強的刺激骨吸收因子，隨著絕經后婦女雌激素分泌量降低，機體對于IL-1β的拮抗作用降低，故骨吸收加速，導致骨質疏松的形成[11]。而IL-17可增強破骨細胞活性，破骨細胞會通過分泌大量水解酶來溶解骨質，使骨小梁變薄、斷裂，最終形成骨質疏松[12]。IL-1β與IL-17在炎癥反應中有聯動關系，IL-1β首先激活一氧化氮合酶而產生一氧化氮，一氧化氮誘導軟骨細胞凋亡，并能抑制軟骨細胞增殖和合成蛋白多糖[13-14]；同時IL-1β還會使T 細胞活化，誘導產生IL-17而降解軟骨細胞基質，降低成骨細胞活性而破壞骨微結構[15]。因此，抑制IL-1β與IL-17所造成炎性反應成為防治骨質疏松時骨質破壞及可能發生椎體壓縮骨折的關鍵。

本實驗首先用雌性家兔去卵巢建立家兔骨質疏松模型，再在此基礎上建立椎體壓縮骨折模型，目的是真實模擬老年女性骨質疏松性椎體壓縮骨折病理進程。 結果發現，灌胃20 d和30 d后，青藤堿A組和青藤堿B組骨痂生長良好，綜合評分均明顯高于灌胃10 d和模型組；青藤堿A組和青藤堿B組血清IL-1β、IL-17均明顯低于灌胃前及模型組。提示青藤堿可抑制IL-1β、IL-17表達，抑制軟骨細胞凋亡，促進骨折愈合。

目前關于GDF2與骨質疏松的關系研究較少，GDF2為骨形態發生蛋白9，屬于轉化生長因子，能夠誘導鈣鹽沉積，并可誘導間充質干細胞分化為骨、軟骨[16]。本實驗結果顯示，青藤堿A組和青藤堿B組GDF2和GDF2 mRNA表達水平均明顯高于模型組，提示青藤堿可誘導骨鈣沉積，提高成骨細胞活性，促進骨痂形成。

綜上所述，青藤堿可以通過抑制IL-1β、IL-17介導的炎性反應，提高GDF2誘導成骨分化和骨形成能力，從而促進骨痂生長而加速骨折愈合，為青藤堿用于治療老年女性骨質疏松性椎體壓縮骨折提供了一定依據。但本實驗中不同劑量青藤堿未顯示出作用差異，有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 吳小川. 鹿瓜多肽注射液對高齡骨質疏松性骨折愈合的影響[J]． 實用藥物與臨床，2014，17(3)：356-358

[2] 李翔，張樹桐，王翔，等. 骨質疏松或骨轉移瘤致椎體壓縮性骨折患者的MRI鑒別研究[J]. 吉林醫學，2017，38(1)：44-45

[3] 楊惠琴，陳禮榮. 青藤堿對膝骨性關節炎兔關節液及血清白細胞介素lβ含量的影響[J]. 中西醫結合學報，2008，6(12)：1275-1279

[4] 姚金丹，韓光紅，胡敏，等. IL-17對破骨細胞中MMP-9表達水平的影響及其意義[J]. 吉林大學學報：醫學版，2016，42(3)：462-466

[5] 羅進勇. 骨形態發生蛋白9促成骨的分子機制[J]. 重慶醫學，2016，45(9)：1153-1355

[6] 張欣悅，高永翔. 青藤堿的免疫抑制和抗炎活性研究進展[J]. 湖南中醫雜志，2016，32(3)：193-194

[7] 楊惠琴，陳禮榮. 青藤堿注射液對兔膝骨性關節炎關節液及血清 IL-6水平的影響[J]． 中醫藥導報，2007，13(10)：62-63；72

[8] 盧其騰，農小連，吳家昌，等. 去勢聯合地塞米松建立大鼠骨質疏松模型的研究[J]． 中國骨質疏松雜志， 2015，21(1)：34-38

[9] 張淑嫻，郭新全，邱玉金，等. 兔椎體骨折動物模型制備的初步探討[J]. 動物醫學進展，2013，34(7)：131-134

[10] 崔健超，江曉兵，楊志東，等． 胸腰椎椎體骨折動物模型的研究進展[J]． 中國脊柱脊髓雜志，2015，25(7)：666-669

[11] 吳迎爽，朱亦堃. 吡格列酮對去卵巢大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α 的影響及與骨代謝關系的實驗研究[D]． 太原：山西醫科大學，2012

[12] 邵泓達，湯光宇. 去勢骨質疏松的發病機制研究進展[J]． 上海醫學，2014，37(1)：94-96

[13] 朱書濤，劉洋，張明輝，等. 去卵巢大鼠骨組織中腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β及白細胞介素6水平與骨質疏松的關系[J]. 中國組織工程研究，2016，20(15)：2206-2211

[14] 羅浩，鄭潔，權志博，等. 關節腔注射青藤堿對兔膝骨性關節炎血清NO等自由基代謝的影響[J]. 現代檢驗醫學雜志，2014，29(2)：60-63

[15] 丁從珠，姚瑤，方蕓，等. 青藤堿對膠原誘導的關節炎大鼠血清OPG/RANKL、lL-17含量的影響[J]． 南京中醫藥大學學報，2012，28(4)：330-333

[16] 馬軍，孫崇毅，劉慶鵬，等. BMP9在脊柱融合過程中的作用及其相關機制研究進展[J]． 現代醫學，2014，42(6)：703-706