蒽酮-硫酸顯色法測定栽培白及的白及多糖含量*

李德旺，鄧 芳，汪 勝

（湖南省衡陽市食品藥品檢驗檢測中心，湖南 衡陽 421001）

白及具有收斂、止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，用于治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、潰瘍出血等癥，富含白及膠[1]?，F代藥理研究表明，白及膠能抑制腫瘤血管生成，兼有抗感染、抗腫瘤和促進凝血的功能[2-3]，其主要成分為大分子多糖[4]。2015年版《中國藥典（一部）》對白及的質量控制僅見性狀、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，未對白及中具有藥理活性的白及多糖進行質量控制。為評價栽培白及內在質量，本研究中采用蒽酮-硫酸顯色法測定其多糖含量，并與野生白及進行比較，探討其變異性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Cary60型紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；Mettler Ae 240型電子天平（瑞士梅特勒公司）；GZX-9146MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）；TG16-Ⅱ型醫用離心機（湖南平凡科技有限公司）。

1.2 試藥

D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號為110833-201506，濃度為100%）；蒽酮（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20170706）；硫酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20170108）；試驗用水為試驗室自制純化水。野生白及（湖南衡岳中藥飲片有限公司，采于湖南南岳后山區，批號為171003，171004）；栽培白及（湖南衡岳中藥飲片有限公司中藥材種植基地，批號為 160901，160902，171001，171002）；市售白及（市場購入，產地云南，批號為 20161201，170511），以上藥材均經本中心副主任中藥師王先教鑒定為蘭科白及屬植物白及 Bletilla striata（Thunb.ex A.Murray）Rchb.f.的干燥塊莖，且符合藥典標準[5]。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

試液：0.2%蒽酮-硫酸溶液的配制，取蒽酮，精密稱定0.301 2 g，加80%硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻即得（棕色瓶保存或臨用時配制）。

對照品溶液：取 D-無水葡萄糖對照品，精密稱定0.032 38 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（D-無水葡萄糖對照品使用以100%計，即每1mL中含 D-無水葡萄糖0.3238mg）。

供試品溶液：取經60℃干燥12 h的白及供試品粉末0.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入60 mL水，加熱回流提取1 h，趁熱用布氏漏斗濾過，殘渣及燒瓶用熱水洗滌3次，每次10 mL，合并濾液和洗液，放冷，轉移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，溶液濾過，精密量取續濾液0.5 mL，加入4 mL丙酮，搖勻，靜置10 min，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取2 mL，照標準曲線制備項下方法，自“在冰水浴中緩緩加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度”起，依法測定吸光度，計算百分含量。

2.2 檢測波長選擇

取對照品溶液，稀釋成0.009 7 g/L，按標準曲線制備項下方法顯色后，在200～800 nm波長范圍內掃描，色譜圖見圖1。選取最大吸收波長582 nm作為檢測波長。

圖1 D-無水葡萄糖紫外吸收光譜圖

2.3 方法學考察

標準曲線制備：精密量取對照品溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分別置 10 mL 具塞試管中，各加水至2.0 mL，混勻，在冰水浴中緩緩加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應試劑為空白。照紫外-可見分光光度法，在582 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標、質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程 Y=24.11X-0.001，R2=0.996（n=6）。結果表明，D-無水葡萄糖質量濃度在3.238～19.428 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液（0.097 1 g/L），按擬訂色譜條件，重復進樣6次，測定。結果吸光度平均值為 0.252 9，RSD 為 0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：稱取樣品（批號為171001）6份，依法測定，計算含量。結果平均含量為34.44%，RSD為0.32%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取白及（批號為171001），依法制備供試品溶液，分別于放置 20，40，60，90，120，150 min 后上樣測定。結果的 RSD為1.27%（n=6），供試品溶液在90 min內 D-無水葡萄糖吸光度基本穩定。

加樣回收試驗：取樣品（批號為171001）精密稱定0.3 g 6份，分別精密加入0.032 4 mg的 D-無水葡萄糖，依法測定。結果見表1。

表1 D-無水葡萄糖加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

結果見表2。

表2 不同批次白及多糖含量測定結果（以 D-無水葡萄糖計，n=6）

3 討論

3.1 顯色法選擇

考察了苯酚-濃硫酸顯色法，其樣品測定結果重復性較差，且苯酚毒性較大，易氧化，試驗前需進行純化處理[6-7]，操作煩瑣；而蒽酮-硫酸顯色法測定結果較穩定，操作簡便，故采用蒽酮-硫酸顯色法進行測定。

3.2 樣品提取方法選擇

比較了以稀乙醇去雜質再水提的方法與水提醇沉法測定白及多糖含量，2種方法測定結果較接近，但前者過濾時間太長，后者操作簡便，故選擇水提醇沉法。

3.3 方法優勢

紫外分光光度法是一種常用的分析方法，應用范圍廣，成本較低，操作快速、簡便，同時具有良好的穩定性和重復性[8]；2015年版《中國藥典（一部）》白及項下的相關檢測項不能對其具有藥理活性的相關成分進行相應評價，方法精密度、重復性和準確度良好，可作為評價其內在質量的參考方法。

3.4 樣品測定情況分析

結果顯示，栽培白及2年生樣品與3年生樣品相比，白及多糖含量差異顯著，栽培白及3年生樣品白及多糖含量與野生白及、市售白及相近，表明栽培白及采挖時限至少3年；結合其外在形態特征符合藥典標準，表明該種植基地從野外引種的白及栽培變異不明顯，植物形態穩定，野生引種塊莖繁殖的技術方法可行，可加大規模種植和推廣力度。同時，將繼續跟進該種植基地，研究4年生、5年生白及的白及多糖含量，篩選效益最高、質量最優的種植方案。

[1]肖培根.新編中藥志（第一卷）[M].北京：化學工業出版社，2001：320.

[2]馮敢生，李 欣，鄭傳勝，等.中藥白芨提取物抑制腫瘤血管生成機制的試驗研究[J].中華醫學雜志，2003，83（5）：412.

[3]徐小爐，尹 劉，程元芝，等.白芨栓塞治療中晚期肝癌的臨床觀察[J].實用癌癥雜志，2000，15（6）：640-641.

[4]羅新根，劉文庸，張衛東.中藥白及的化學成分及臨床研究進展[J].藥學實踐雜志，1999，17（6）：359.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：103.

[6]丁 玲，王 東，張中林，等.不同商品地山藥多糖含量的分析[J].遼寧中醫藥大學學報，2009，11（4）：187-188.

[7]楊 春，楊金笛，林 帥.菊花、野菊花中的總糖含量測定[J].山西中醫，2009，24（6）：40-41.

[8]王 雷，楊新建，寇 欣.紫外分光光度法在中藥分析中的應用進展[J].天津藥學，2003，15（5）：62-64.