高效液相色譜法測定人血清萬古霉素濃度

李 容

（重慶市涪陵中心醫院藥學部，重慶 408000）

萬古霉素是有抗生素后效應的時間依耐性抗菌藥物，抗感染治療成敗與其血藥谷濃度密切相關，血藥谷濃度應控制在10～20 mg/L，至少要保持在10 mg/L以上，以避免發生耐藥[1]。萬古霉素的用藥人群包括新生兒、嬰幼兒、老年人、腎功能不全及長期應用萬古霉素的患者等特殊人群，應用時必須嚴格調整劑量，并進行血藥濃度監測。本研究中用高效液相色譜（HPLC）法測定人血清中萬古霉素濃度，不僅可以為臨床萬古霉素的血藥濃度監測提供試驗手段，為臨床合理用藥提供理論依據，還可為患者制訂個體化給藥方案，減少用藥后的不良反應。目前，國內外對人血清中萬古霉素的濃度監測方法有6類，即微生物檢測法[2]、酶放大免疫法（EMIT）[3]、熒光偏振免疫法（FPIA）[4]、液相色譜 -質譜聯用法（LC-MS/MS）[5]、離子對色譜法[6]、高效液相色譜法。由于微生物檢測法耗時較長且精密度低，EMIT和FPIA的專屬性較差，LC-MS/MS法儀器價格昂貴致前期投入較大，而高效液相色譜法具有提取率高、重復性好、穩定性好、靈敏度高、操作簡便等特點，因此，我院亦采用HPLC法測定萬古霉素的血藥濃度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2401PC型紫外分光光度計（日本島津公司）；高精度電子天平（上海光正醫療儀器股份有限公司）；pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；TG16W型醫用高速離心機（長沙平凡儀器儀表股份有限公司）；TD4B型醫用離心機（長沙平凡儀器儀表股份有限公司）。

1.2 試藥

萬古霉素標準品（中國食品藥品檢定研究院，純度為 99%，批號為 130360-201302）；甲醇（批號為20160601），乙腈（批號為 20151111），均為色譜純，由美國Burdick&Jackson公司提供；磷酸二氫鉀（批號為2016042801），三氯乙酸（批號為 2016073101），均為分析純，由成都市科龍化工試劑廠提供；磷酸（分析純，重慶川東化工集團有限公司，批號為20160509）；試驗用水為本院自制重蒸餾水，空白血清為本院檢驗科采集。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：VP-ODSC18柱（150mm×4.6mm，4.6μm）；流動相：0.05 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH=3.2）-甲醇（83∶17）；流速：1mL/min；紫外檢測波長：205nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液配制

流動相配制：取磷酸二氫鉀6.805 g，精密稱定，置1000mL燒杯中，用1000mL蒸餾水溶解，攪拌均勻，用磷酸調節溶液的pH，緩慢滴加，邊滴加邊用玻璃棒攪勻，直至溶液的pH達3.2，即配制成0.05mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH=3.2），置陰涼處保存，備用。

標準貯備液：取0.045 0 g萬古霉素標準品，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，搖勻，即配制成質量濃度為980 μg/mL的標準貯備液，于冰箱中4℃冷藏，備用，使用時稀釋為所需質量濃度。

蛋白沉淀劑：稱取三氯乙酸10 g，用純化水溶解至100 mL，搖勻，即得10%三氯乙酸溶液，用微量移液器分別移取1 200 μL 10%三氯乙酸溶液和300 μL乙腈置EP管中，震蕩搖勻，置陰涼處保存，備用。

2.3 血清樣品預處理

抽取使用過萬古霉素患者的靜脈血約3 mL，置普通抽血管中，以2 500 r/min的速率離心5 min，取上層血清樣品 200 μL，置 2.0 mL EP 管中，再加入 150 mL蛋白沉淀劑[10% 三氯乙酸 -乙腈（1 200 μL ∶300 μL）]，以12 000 r/min的速率離心15 min，取上清液 20 μL進樣。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：在選定的樣品處理方法和色譜分離條件下，測定空白血清、空白血清加標準品及血清樣品的色譜峰。按擬訂色譜條件進樣測定，血清中干擾物質峰主要出現在12.5 min前，故把萬古霉素的保留時間（tR）控制在14 min左右，萬古霉素與血清中的干擾物質能得到良好分離，同時分離時間也不太長，保證了實驗時間的合理性和可控制性。色譜圖見圖1。

線性關系考察：用微量移液管分別取10，20，40，60，80，100，120 μL 萬古霉素標準貯備液，置 2.0 mL EP管中，分別加入純化水 190，180，160，140，120，100，80 μL，振蕩 3 min，搖勻；取上述溶液各 20 μL 置另一系列EP管中，各加入180 μL空白血清，振蕩3 min搖勻，配置成質量濃度分別為 4.90，9.80，19.60，29.40，39.20，49.00，58.80 μg/mL 的溶液；再各加入 150 μL蛋白沉淀劑，振蕩3 min，搖勻；最后置離心機中，以12 000 r/min的速率離心15 min，取出；按擬訂色譜條件進樣測定，以質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=26 385X-19 207，r=0.999 6（n=7）。結果表明，血清質量濃度在 4.90 ～58.80 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好；最低檢測限為 1.96 μg/mL（n=7）。

精密度試驗：取適量萬古霉素標準溶液加至180 μL空白血清中，分別配制成質量濃度為 9.80，19.60，29.40，39.20 mg/L 的血清樣品溶液，按專屬性試驗方法處理樣品，吸取上清液20 μL直接進樣，1 d內重復測定5次，每次分析17 min，連續測定5 d。結果見表1。可見該方法的日內、日間 RSD均低于4%（n=5）。

絕對回收率試驗：精密吸取萬古霉素對照品貯備液，配制質量濃度為 9.80，19.60，29.40 mg/L 的萬古霉素血清樣品，按2.2項下方法處理樣品，每一質量濃度平行操作5份，取20 μL進樣，將儀器檢測到的質量濃度與實際配制質量濃度相比得方法回收率，詳見表2。

圖1 高效液相色譜圖

表1 日內、日間精密度試驗結果（n=5）

表2 絕對回收率試驗結果（n=5）

穩定性試驗：制備 4.9，39.2，58.8 μg/mL 低、中、高3種質量濃度萬古霉素血清樣品各3份，于冰箱冷藏室（2～8℃）冷藏 1，2，4 d，考察其穩定性，結果見表 3。

表3 穩定性試驗結果（n=3）

2.5 臨床應用

2.5.1 病例分析

患者，男，50歲，體質量60 kg，因糖尿病伴多種并發癥及肺部感染，于2017年1月23日入住重癥監護室（ICU），入院后立即給予心電監護、吸氧、保留導尿、建立靜脈通道、行床旁心電圖。微生物檢查報告導管血及導管尖端培養均有表皮葡萄球菌感染，痰培養提示有肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌感染。結合患者病情考慮為導管相關膿毒血癥，給予萬古霉素、氟康唑、哌拉西林他唑巴坦等抗生素進行抗感染治療。在使用萬古霉素前，患者的血清肌酐為417.7 μmol/L，肌酐清除率為 15.80 mL/min，醫師給予“萬古霉素 1 g，q12 h”靜脈微泵輸入，連用3 d后于再次給藥前取患者血清，送檢，用HPLC法測定萬古霉素的血藥濃度，測定值為48.71 μg/mL（重癥患者參考值為 15 ～20 μg/mL），醫師調整給藥方式為“0.5 g，biw，ivgtt”，24 h 后測定患者的血肌酐為 686.1 μmol/L，肌酐清除率為 9.62 mL/min，仍持續使用萬古霉素等抗生素1周后，靜脈導管尖端培養未見細菌生長，患者病情好轉，一般情況尚可，腎功能損害較大，轉出ICU，轉入腎內科病房繼續治療。

表4 FPIA法與HPLC法測定萬古霉素標本的結果

2.5.2 FPIA法與HPLC法測定結果比較

標本來源為重慶醫科大學附屬兒童醫院。利用SPSS統計軟件分析，對數據進行兩獨立樣本 t檢驗，分析結果認為，兩總體的方差無顯著差異。說明我院用HPLC法與重慶醫科大學附屬兒童醫院FPIA法2種方法測定人血清中萬古霉素的濃度的結果無顯著性差異，表明我院建立的HPLC法測定萬古霉素血藥濃度方法可行。詳見表4。

2.5.3 我院臨床標本的測定

2016年11月至2017年3月，我科為ICU監測萬古霉素血藥濃度5次，測定結果見表5。

表5 我院臨床ICU標本萬古霉素測定結果

3 討論

3.1 測定波長選擇

將質量濃度為10 mg/L的萬古霉素標準品溶液，以水作為空白對照在UV-2401PC型紫外分光光度計下進行掃描。結果，萬古霉素在280 nm波長處有最大吸光度，有末端吸收；高效液相色譜法試驗表明，280 nm處的吸收峰面積為205 nm波長處的吸收峰面積的1/7，故選擇檢測波長為205 nm。

3.2 流動相選擇

曾考察了流動相系統中兩種成分的不同比例對有效成分分離的影響，甲醇 -0.05 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液（pH=2）的比例分別為16∶84和17∶83，等度洗脫。結果表明，兩種流動相系統都能使萬古霉素與雜質峰分開，但當甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH=3.2）的比例為17∶83時萬古霉素有較好的分離，分離度為 1.900，拖尾因子為 1.052，tR為 14 min，故最終選擇后者（17∶83）為流動相。

3.3 蛋白沉淀劑優化

選擇4種蛋白沉淀劑考察沉淀蛋白的效果，分別為10%硫酸鋅溶液、10%三氯醋酸溶液、10%高氯酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取、10%三氯乙酸和乙腈（4∶1）。結果顯示，10%硫酸鋅溶液沉淀蛋白不完全，離心后上清液渾濁無法直接進樣；10%三氯乙酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取，處理血樣時操作煩瑣，二氯甲烷萃取離心后水層不宜吸出；10%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，離心后上清液澄清，但提取率只有33%，10%高氯酸和乙腈（4∶1）沉淀蛋白，離心后上清液澄清，提取率可達70%，所以最終選擇10%三氯乙酸和乙腈（4∶1）作為血清蛋白沉淀劑。

3.4 研究價值

耳、腎毒性是萬古霉素最嚴重的不良反應，其發生與血藥濃度過高有關，臨床應用時常通過監測血藥濃度來降低耳、腎功能損害風險。HPLC法提取率高，重復性好，操作簡便、靈敏，適用于臨床患者使用萬古霉素后的血藥濃度測定。本研究使為患者進行個體化給藥、優化給藥方案和提高臨床療效成為可能。

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