川芎促血管舒張有效部位中阿魏酸的含量測定

2018-06-26 08:07:30陳志民劉建清郭瑩瑩謝奇恩甘惠貞王佳坤

中國藥業 2018年7期

陳志民，劉建清，郭瑩瑩，林紅，謝奇恩，甘惠貞，王佳坤 △

（1.中國人民解放軍第180醫院，福建泉州 362000； 2.南京軍區聯勤部機關幼兒園保健室，江蘇南京 210001）

川芎為傘型科植物川芎的干燥根莖，臨床主要用于治療胸痹心痛、胸肋刺痛、跌打腫痛、月經不調等疾病，因此對其藥理作用、質量鑒定及含量測定的研究都對川芎的臨床實際應用意義重大[1]。關于川芎有效成分的含量測定主要有氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）[2-8]等方法。報道較多的是HPLC和GC-MS法，這2種方法雖然定量比較準確，但需要有純度較高、穩定性較好的對照品，且在分離較好的情況下才能進行定量測定。武亞曉等[9]對阿魏酸的提取工藝及測定方法進行了改進，為進一步的研究奠定了基礎。目前，國內外對川芎的化學成分及藥理作用研究較多，但關于活性部位的質量控制研究相對較少。本試驗中首次采用HPLC法測定具有促血管舒張作用的川芎大孔吸附樹脂洗脫物中阿魏酸的含量，為更深入地研究川芎及其相關質量控制提供了參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200LC型高效液相色譜儀，G1311A型四元泵，G1365B/D型紫外檢測器，Angilent Chemstation色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）；電子天平（萬分之一，賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（超聲頻率為40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；R-205型旋轉蒸發儀（轉速為20～280 r/min，上海申勝生物技術有限公司）；超純水系統（Sartorius Ag Germany arium 611UF S/N：21710655）；AB-8 大孔吸附樹脂（天津南開大學化工廠）。

1.2 試藥

阿魏酸化學對照品（批號為0773-9910，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（Product of Dikma Technologies，色譜純）；川芎飲片購自哈爾濱市三棵樹藥材，經中國人民解放軍第180醫院中醫科李樹清主任醫師鑒定為正品；冰乙酸（批號為 1504231）、乙酸乙酯（批號為1607011）、乙醇（批號為 15102602）等均為分析純，購于西隴化工股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 川芎有效部分的提取流程

提取流程見圖1。

圖1 川芎離體血管舒張有效部位提取流程

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：冰乙酸（濃度為 0.099 5% ）- 甲醇（65∶35）；流速：1 mL/min；檢測波長：322nm；柱溫：20℃；進樣量：10μL。分別進樣阿魏酸對照品溶液和川芎供試品溶液各10μL，在此色譜條件下的色譜圖見圖2，理論板數[n=5.54（tR/W1/2）2]按阿魏酸峰計算應不低于 4000。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取阿魏酸化學對照品6.3 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶，用甲醇溶解，定容至刻度，即得質量濃度為0.63 g/L的溶液，作為對照品貯備液A。分別精密吸取對照品貯備液 4.0，3.0，2.0，1.0 mL 置 5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得不同質量濃度的對照品溶液，記為 B，C，D，E。

供試品溶液：取川芎-60%醇提取部位樣品0.4997g，置錐形瓶中，精密稱定，加入超純水15 mL，超聲20 min，完全溶解，分別用乙酸乙酯（20，20，10mL）萃取 3 次，合并萃取液，揮干提取溶劑，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中并定容至10 mL，搖勻，用移液管精密移取1 mL置10mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：按擬訂色譜條件，精密吸取對照品溶液 A，B，C，D，E 各 10 μL 進樣測定，記錄峰面積，以峰面積（A）對質量濃度（C）作線性回歸，得阿魏酸線性回歸方程 A=3.065 ×104C+99.504（r=0.999 87）。結果表明，阿魏酸進樣量在 1.26 ～6.30 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一質量濃度阿魏酸對照品溶液（溶液 E），在擬訂色譜條件下進樣 10 μL，重復 5次，測定，記錄峰面積。結果的 RSD為0.27%（n=5），表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖

穩定性試驗：取樣品（批號為170608）適量，依法制備供試品溶液，于 0，2，4，8，24 h 時在擬訂色譜條件下分別測定，記錄峰面積。結果的 RSD為0.22%（n=5），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為170608）適量，依法制備供試品溶液，共5份，在擬訂色譜條件下依法測定，記錄峰面積。結果的 RSD為0.08%（n=5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取己知含量的同一樣品5份，精密稱定 0.025 g（相當于阿魏酸 0.743 mg），分別加入一定量的阿魏酸對照品，依法測定，計算含量。結果見表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗結果（n=5）

2.2.4 樣品含量測定

取川芎樣品3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算樣品中阿魏酸的含量。結果見表2。

表2 川芎中阿魏酸含量測定結果（%，n=3）

3 討論

在對流動相組成及檢測器波長的選擇中，分別以甲醇 - 冰乙酸（體積分數為 0.099 5%）為 30 ∶70，35 ∶65，40 ∶60 進行試驗，并記錄了 230，278，313，322 nm 4 個波長的色譜圖。結果表明，用甲醇-冰乙酸（35∶65）作為流動相，波長為322 nm的色譜條件為最佳。在此色譜條件下，川芎有效部位的供試品溶液可檢出4個主要色譜峰，且保留時間跨度較大，分離效果較好。

在供試品制備時發現，阿魏酸對熱乙酸乙酯有較好溶解度，故采用乙酸乙酯對樣品進行萃取處理[10-12]，結果得到了驗證，該有效部位中的阿魏酸平均含量達2.97%，遠高于文獻[5]報道的川芎藥材中阿魏酸0.075% ～0.14%的含量。同時對阿魏酸的提取時間進行了考察，發現當提取時間大于1h，或提取次數大于2次時，阿魏酸的提取量并未明顯增加。綜合考慮時間-成本關系，最后阿魏酸的提取條件定為乙酸乙酯提取2次，每次1 h。

阿魏酸有順式和反式兩種立體結構，原藥材和制劑中阿魏酸以反式結構存在，但隨著放置時間的延長，反式阿魏酸會慢慢轉化為順式結構。文獻[6]報道了阿魏酸的穩定性問題，在48 h內，僅有約1%的反式阿魏酸轉化為順式阿魏酸，對定量分析而言，在測定誤差允許范圍內。為保證阿魏酸的穩定性和對川芎質量控制的準確性，本試驗中考察了對照品和供試樣品在24 h內的穩定性，并保證對照品與供試品在該時間內使用，保證了試驗數據的可靠性。

阿魏酸作為川芎的有效成分，常用于藥材及其制劑的質量控制指標。這主要是因為阿魏酸具有抗血小板凝集、抑制5-羥色胺從血小板中釋放、阻止靜脈旁路血栓形成、抗動脈粥樣硬化、清除自由基等作用[13-17]。今后的試驗中，將在提取阿魏酸的基礎上，進一步開展藥效學研究，如抗心肌缺血和抗腦缺血試驗，以期得到完善的藥效學試驗結果。

傳統中藥材是在傳統中醫藥理論指導下使用，有著幾千年的用藥經驗，其療效確切、可靠，特別是經典處方，在某些特定疾病中發揮著重要作用，但中藥材有其自身不足，如在臨床應用中存在著成分不明，易引起不良反應，且需要較大劑量的問題。本試驗中提取藥材的單一有效成分阿魏酸有助于后期藥效學的研究，且提取后的阿魏酸臨床應用更方便，可相對克服以上中藥材存在的不足。

[1]張翠英，章洪，戚瓊華.川芎的有效成分及藥理研究進展[J].遼寧中醫雜志，2014，41（10）：2264-2266.

[2]盧歡，唐曉丹，李博.超聲輔助萃取川芎中阿魏酸工藝的優化[J].湖北農業科學，2016，55（9）：2235-2238.

[3]何書連.HPLC法測定不同產地川芎中阿魏酸的含量[J].黑龍江醫藥，2014，27（1）：20-22.

[4]李新貴.高效液相色譜測定川芎配方顆粒中阿魏酸的含量[J].兒科藥學雜志，2017，23（6）：49-51.

[5]呂維，吳戀，葉娜，等.HPLC法同時測定川芎藥材中阿魏酸和藁本內酯的含量[J].中藥與臨床，2014，5（2）：13-15.

[6]蘇秀蘭，楊倚麟.薄層析-紫外分光光度法測定川芎中阿魏酸含量[J].安徽農業科學，2016，44（7）：142-144.

[7]楊麗，胡昌江，周維，等.川芎配方顆粒質量標準研究[J].中國藥業，2012，21（10）：28-29.

[8]王虎，李文兵，胡昌江，等.不同產地川芎主要有效成分含量比較[J].中國藥業，2015，24（21）：37-39.

[9]武亞曉，李希，馮建安，等.正交試驗設計優化川芎阿魏酸的提取工藝[J].中藥與臨床，2015，6（3）：22-25.

[10]李艷清，周良芹，王蓉，等.川芎中阿魏酸和川芎嗪的提取及檢測方法研究[J].安徽師范大學學報（自然科學版），2016，39（1）：55-59.

[11]章洪，李振國，張翠英.川芎中阿魏酸類效應組分的提取純化工藝研究[J].安徽農業科學，2014，42（17）：5410-5415.

[12]陳倩潔，孫明，梁瑞雪，等.煎煮時間對川芎中阿魏酸穩定性影響的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2002，13（4）：249-250.