豬藍耳病病毒在白紋伊蚊體內增殖可能性研究

華瑩 李濤 陳眷華 林家棟 王開功 余四九

（1，甘肅農業大學動物醫學院 730070；2，貴州省動物疫病預防控制中心 550008；3，貴州大學動物科學學院 550025）

豬藍耳病病毒即豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是豬藍耳病的病原。豬藍耳病于1987年美國首次發現后，在不到10年時間，PRRS幾乎傳遍全世界養豬國家，其原因可能與PRRSV存在廣泛的傳播途徑有關。PRRSV除了可以直接接觸傳播外，可通過感染公豬的精液、污染的用具和車輛等進行傳播，還可通過母體胎盤和乳汁傳遞給仔豬，特別是蚊、蠅、鼠等傳播PRRSV[1-3]。但這些研究結果均認為，蚊、蠅、鼠等只能機械性攜帶PRRSV，不能作為PRRSV的生物性傳播媒介。

自2006年夏秋以后，我國南方大部分地區爆發了以PRRSV變異毒株引起的高致病性PRRS，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。這些PRRSV變異毒株的主要變異特點是Nsp2基因90個核苷酸不連續缺失和GP5基因點突變。這些基因變異特別是Nsp2基因的90個核苷酸缺失，導致病毒從以侵害呼吸系統和生殖系統為主擴展到可侵染宿主各個組織器官，從而具有極高的發病率和死亡率。值得注意的是，2006年以來發生的高致病性PRRS疫情主要在夏秋溫暖季節[4-6]，這也是蚊蟲滋生活動季節。從上述PRRSV組織嗜性改變和PRRS發生季節等特點，可以推測高致病性PRRSV有可能存在生物性媒介。因此，本研究以我國養豬場常見蚊種之一即白紋伊蚊為實驗對象，研究觀察PRRSV在白紋伊蚊體內增殖的可能性，以期為高致病性PRRSV生物傳播機制研究和PRRS預防控制提供理論依據。

1 材料

1.1 毒株和蚊種

實驗毒株：PRRSV GY株 （106.5 TCID50），為PRRSV變異毒株，從貴陽市郊區某養豬場的發病豬只體內組織器官分離鑒定并保存。

實驗蚊種：白紋伊蚊蟲卵，購自四川大學華西基礎醫學與法醫學院寄生蟲教研室，購回后在實驗室自行孵育和飼養。

1.2 主要試劑

AMV Rtase、 RNase inhibitor、 dNTP （2.5 mmol/L）、 LA Taq DNA聚合酶等，購自大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒，為德國QIAGEN公司產品；高糖DMEM培養液、胎牛血清等，為澳大利亞PAA公司產品；其他試劑，均為分析純。

1.3 主要儀器

Tecnai G2 F20型透射電子顯微鏡和Leica UC6型超薄切片機，為FEI公司產品；PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；凝膠成像儀，上海?，攲嶒炘O備有限公司；NanoDrop分光光度計，美國Thermo公司；Galaxy CO2恒溫培養箱。

2 方法

2.1 白紋伊蚊飼養

取蚊卵濾紙，放入濕潤紗布，置于溫度26～28℃和相對濕度80～90%的蚊蟲飼養房，光照14h/d，孵育24h，放入自然脫氯48h自來水中，孵育成幼蟲 （孑孓）后，加調制呈稀糊狀的豬肝粉飼喂，直至孵化成蛹；吸取蛹蟲，放入盛有自然脫氯48h自來水的燒杯中，置于50cm×50cm×50cm蚊籠；待其羽化成蚊后，放入含5%葡萄糖水的紗布讓其吸食；羽化后3～5d時，加入新鮮豬血讓其吸食，放入盛有濾紙和水的燒杯供其產卵。

2.2 蚊吸病毒液制備

取新鮮培養的PRRSV細胞培養物，反復凍融3～5次，4℃ 12000rpm離心10min，取上清液與新鮮豬血按1∶1比例混勻，即為蚊吸病毒液，現配現用。

2.3 白紋伊蚊吸染PRRSV

取羽化3～5d成蚊，停飲葡萄糖水24h，取浸透病毒液的脫脂棉塊2塊，置于蚊籠底部和頂部，供其吸食1h后放入冰箱凍麻，挑取飽血成蚊移入蚊籠，按常規方法進行飼養，收集不同飼養時間成蚊，放入冰箱凍死備用。

2.4 病毒總RNA提取

取吸染PRRSV后不同時間段的成蚊及其世代樣本，生理鹽水漂洗后置于預冷研缽，快速研磨并收集至離心管，加入適量RNAisoTM Plus試劑及其1/5體積氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，4℃12 000r/min離心15min，取上清移至新離心管，加等體積異丙醇，室溫靜置10min，4℃12 000r/min離心10min，棄上清液，加75%乙醇1ml清洗沉淀，4℃12 000r/min離心5min，棄上清，干燥后用40μl DEPC水溶解，即為蚊蟲病毒總RNA樣本。

2.5 病毒RT-PCR檢測

取蚊蟲RNA樣本，采用PRRSV N基因引物 （5/-TCATCGCCCAACAAA ACCAG-3//5/-GCGTCGGCAAACTAAACTCC-3/，預期擴增長度為240bp）進行RT-PCR擴增，擴增條件為：42℃水浴反轉錄1h，94℃預變性10min，94℃變性30s、55℃退火30s和72℃延伸40s，34個循環，72℃延伸10min。取8μl擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果。

2.6 病毒粒子電鏡觀察

由四川大學分析測試中心電鏡室完成，即取成蚊樣本，3%戊二醛浸泡固定過夜，PBS清洗，4℃1%鋨酸固定2h，PBS清洗，放入30%、50%和70%丙酮醋酸鈾，4℃脫水10min，放入80%、90%和100%丙酮中，室溫脫水10min；在1∶1純丙酮/包埋液混液和包埋液浸透2h，包埋后行超薄切片，醋酸雙氧鈾液染色20min，電子顯微鏡觀察結果。

3 結果

3.1 吸染后白紋伊蚊成蟲體內病毒RT-PCR檢測結果

取不同時間段白紋伊蚊的總RNA提取樣本，采用PRRSV N基因特異性引物進行RT-PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。

圖1 白紋伊蚊體內PRRSV RT-PCR檢測結果M：200bp DNA Markers；1：陽性對照；2-12：0h～7d蚊蟲樣本；13：陰性對照

從圖1可看出，吸染PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊樣本中可檢測出PRRSV N基因特異性片段 （240bp），而吸染PRRSV后30h、36h、42h、48h、120h和168h成蚊樣本中均未能檢出，說明PRRSV在白蚊伊蚊體內只能存在24h左右，不能長時間存留。

3.2 吸染后白紋伊蚊世代體內病毒RT-PCR檢測結果

取吸染 PRRSV后成蚊所產蚊卵孵育 24h、48h、96h、168h幼蟲和蛹及其24h、72h成蚊的RNA樣本進行RT-PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2所示，在各個世代蚊樣本中均未檢測出PRRSV N基因特異性片段，提示PRRSV不能在蚊中進行世代傳遞。

3.2 白紋伊蚊成蟲體內病毒電子顯微鏡觀察結果

取吸染PRRSV后12h、24h、48h和120h的白紋伊蚊樣品，常規方法固定，送至四川大學分析測試中心電鏡室進行超薄切片，電鏡觀察，結果見圖3所示，吸染PRRSV后12h、24h、48h和5d的蚊樣本中均未觀察到PRRSV病毒粒子，提示白紋伊蚊可能只是機械性攜帶PRRSV。

4 討論

我國國土地域遼闊，地理景觀復雜多樣，媒介昆蟲種類繁多，僅蚊蟲種類就達600多種。貴州為云貴高原山地，平均海拔500m左右，氣候溫和，雨水充沛，年平均氣溫16℃左右，為蚊蟲生存提供了適宜的自然條件。研究資料顯示，我國南方地區養豬場孳生的主要優勢蚊種是三帶喙庫蚊（Culex tritaenior-hynchus）、 白紋伊蚊 （Aedes albopictus）和致卷伊蚊 （Culex quinquefasciatus）等，其中白紋伊蚊 （Aedes albopictus）是貴州省大部分養豬場的主要優勢蚊種之一。白紋伊蚊雖在南方養豬場中的數量沒有三帶喙庫蚊數量多，但其分布比三帶喙庫蚊廣泛，從我國南方向北至沈陽市，西北至隴縣、寶雞市，西南至西藏自治區都有白紋伊蚊的存在，而且外界野生的白紋伊蚊種群數量大，活動季節長，吸血性強，嗜吸人血，兼吸哺乳動物血[7,8]。資料顯示，白紋伊蚊可以攜帶日本乙型腦炎病毒 （Japanese encephalitis virus,JEV）、夏季腦炎病毒 （Spring-summer encephalitis virus,SSEV）、新疆出血熱病毒 （Xinjiang haemorrhagic fever virus,XHFV）和登革熱病毒 （Dengue fever virus,DENV）等。目前，從事病原生態學或寄生蟲學研究的科研院所實驗室所馴化的蚊種主要是白紋伊蚊，且主要馴以吸實驗白鼠、仔豬等動物血為主。因此，本研究選擇白紋伊蚊作為實驗對象。

圖2 各世代蚊體內PRRSV RT-PCR擴增結果M：100bp DNA Markers，1：陽性對照，2：蚊卵，3-6：1d/2d/4d/7d幼蟲；7：蛹，8-9：1d/3d成蚊，10：陰性對照

PRRSV為套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒成員，其基因組為單股正鏈RNA，包含9個開放閱讀框，其中ORF7基因即N基因在PRRSV基因組中高度保守，所編碼的N蛋白在病毒粒子中含量也高達40%[9,10]。可見，N基因是PRRSV基因組中最保守也是表達量最高的基因，在PRRSV實驗室檢測上得到廣泛的應用。因此，本研究選擇N基因作為蚊蟲樣本中PRRSV檢測的首選基因。

病毒的生物性媒介需要具備兩個基本條件[11,12]：一是病毒能在其體內進行增殖并達到有效的致病濃度；二是增殖的病毒粒子能在其體內存留5～14d以上。研究資料顯示，日本乙型腦炎病毒、登革熱病毒等均可在白蚊伊蚊體內進行增殖，具備上述條件，可作為這些病毒的生物性傳播媒介。但白蚊伊蚊是否能作為高致病性PRRSV的生物性傳播媒介，需要實驗證明。本實驗通過吸染高致病性PRRSV后，采集不同時間段白紋伊蚊成蚊進行PRRSV N基因檢測和蚊蟲體內病毒粒子觀察，結果顯示吸染 PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊樣本中檢測到PRRSV核酸，時間不超過2d，且電子顯微鏡觀察各個階段白蚊伊蚊體內均未見到PRRSV病毒粒子。這些結果提示，PRRSV不能在白蚊伊蚊體內進行增殖，也就是說白蚊伊蚊不是PRRSV的生物性傳播媒介，只是吸食含PRRSV感染豬血后可機械性攜帶而已。

圖3 不同吸染時間蚊樣本電鏡觀察結果1.吸染12h蚊樣本；2.吸染24h蚊樣本；3.吸染48h蚊樣本；4.吸染120h蚊樣本

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