海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體的制備、表征及其在食品模擬體系中的釋放

龍 門，周 卉，謝 文，廖 琪，王 冉*

（1.江蘇省農業(yè)科學院食品質量安全與檢測研究所，江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，農業(yè)部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室，南京 210014；2.滁州學院生物與食品工程學院，安徽省熱敏性物料加工工程技術中心，安徽 滁州 239000）

噬菌體廣泛存在于自然界中，烈性噬菌體可感染或裂解細菌，目前已經廣泛應用在對人類疾病的治療方面[1-2]。近年來，通過噬菌體殺菌已經得到了廣泛的應用，其中彎曲桿菌[3]、大腸桿菌[4-5]、假單胞菌[6]、熱死環(huán)絲菌[7]、沙門菌[8]和李斯特菌[9]等均有大量的研究。從食品安全的角度來說，噬菌體是預防和控制一些有害細菌，而不干擾自然生物群落細菌的最佳方式[10-11]，噬菌體不僅可以提高食品的安全性，而且也不會改變食物的色、香、味[12]，在溫度低至1 ℃時仍然能夠裂解宿主細胞，可抑制冷藏食品中細菌（特別是嗜冷菌）的生長，并且一旦食品取出置于室溫條件下，噬菌體便可進一步控制其增殖。雖然噬菌體具有巨大的應用優(yōu)勢，并且已經取得了廣泛的應用，但是由于其保存時間相對較短的特點也限制了在食品、醫(yī)藥領域中的應用范圍。研究表明，浮游狀態(tài)的噬菌體穩(wěn)定性極差，在室溫條件下貯藏6～12 h后即失活，嚴重制約了其應用范圍[13-14]。

微囊化技術是一種常用的活性物質包埋技術，該技術不但可以通過包埋法固定活性物質以提高其穩(wěn)定性，還可以通過包埋技術調控活性物質的釋放速率，以增加活性物質的應用可能性[15-16]。O’Brien等[17]通過功能性油脂微囊粉的加工，極大地促進了其應用可行性及穩(wěn)定性；Burgain等[18]通過微膠囊成功開發(fā)了益生菌的包埋技術，并且應用至工業(yè)化生產中。盡管活性物質微囊化技術具有諸多優(yōu)點，已經在醫(yī)藥、食品包裝、生物技術、環(huán)境保護等領域得到了廣泛的應用，但是該技術并不能實現對活性物質的全部包埋，即在微囊化過程中會導致部分活性物質的損失[19-20]。因此，針對不同活性成分制定合適的微囊化工藝是該技術使用的前提。

JS25噬菌體分離于牛奶廠污水中，屬于肌尾噬菌體科噬菌體，具有極強的細菌裂解能力，可以較好地感染并殺死宿主細胞[21]；并且該類噬菌體可以應用到食品的重要優(yōu)勢是其沒有遺傳功能并不能轉錄細菌DNA，并且可以通過高效價感染殺死宿主細胞[22]。目前國內外對于噬菌體微囊化工藝的研究相對較少，并且針對海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體及其結構表征的研究鮮見報道。因此，本實驗通過海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體，并對制備的JS25噬菌體微囊粉進行結構表征，通過構建4 種不同的食品模擬體系，建立微囊化JS25噬菌體在不同食品模擬體系中的釋放模型，以期為噬菌體在食品非熱殺菌的應用中提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

vB_SauM_JS25噬菌體（以下簡稱JS25噬菌體）由江蘇省農科院食品質量安全與檢測研究所提供，分離自奶牛場污水；金黃色葡萄球菌ATCC6538 北京陸橋技術有限公司；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、Baird-Parker培養(yǎng)基 青島新希望生物科技有限公司；MgSO4、CaCl2、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、海藻酸鈉、鹽酸（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱 韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；TXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FA2204B電子天平 上海越平科學儀器有限公司；R-134A型恒溫振蕩搖床 美國熱電公司；JL-1166型激光粒度分布測試儀 成都精新粉體測試設備有限公司；JSM-6510掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

SM緩沖液：稱取硫酸鎂2 g、氯化鈉5.8 g、溶解于900 mL去離子水中，再加入50 mL 1 mol/L的Tris-HCl溶液，去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

微球破解液：稱取檸檬酸鈉14.7 g，碳酸氫鈉16.8 g，溶于1 L的SM緩沖液中，0.22 μm濾膜過濾除菌，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體的制備[23-24]

將4 ℃保存的金黃色葡萄球菌噬菌體JS25采用液體增殖法擴增培養(yǎng)。將所需的海藻酸鈉溶解于100 mL、50 mmol/L Tris-HCl溶液中（pH 7.5），然后加入噬菌體懸液，攪拌混勻，噬菌體終濃度約為107PFU/mL，真空脫氣除去溶液中氣泡。將上述溶液用2 mL無菌注射器逐滴滴入所需的CaCl2溶液中形成海藻酸鈣凝膠，（20±2）℃靜置硬化30 min。過濾收集微球，用去離子水洗滌后，于4 ℃生理鹽水中保存待用。將收集到的微球于4 ℃干燥，密封保存。

1.3.3 單因素試驗

固定CaCl2添加量2.0 g/100 mL，分別以2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 g/100 mL的海藻酸鈉及按照1.3.2節(jié)中的微囊化工藝制備JS25噬菌體微囊粉，分析海藻酸鈉添加量對JS25噬菌體包埋率的影響。

固定海藻酸鈉添加量為4.0 g/100 mL，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/100 mL的CaCl2溶液按照1.3.2節(jié)中的微囊化工藝制備JS25噬菌體微囊粉，分析CaCl2添加量對JS25噬菌體包埋率的影響。

1.3.4 JS25噬菌體微囊粉制備工藝優(yōu)化

在上述試驗的基礎上，分別以海藻酸鈉添加量（X1）為2.5～4.5 g/100 mL、CaCl2添加量（X2）為1.5～3.5 g/100 mL，通過Design-Expert中心組合設計響應面試驗，試驗的因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Coded levels of independent variables used for central composite design

1.3.5 JS25噬菌體微囊粉穩(wěn)定性的測定

以浮游態(tài)JS25噬菌體為對照，分別分析在微囊化前后JS25噬菌體在4 ℃及20 ℃貯藏過程中的效價變化。

1.3.6 JS25噬菌體微囊粉的表征

針對上述實驗制備的JS25噬菌體微囊粉，分別通過測定其粒徑分布及掃描電子顯微鏡結果進行表征。

1.3.7 JS25噬菌體微囊粉釋放性能的測定

分別分析在不同食品模擬體系中的釋放性能，具體食品模擬體系如下[25]：高水分活度食品模擬體系（T1）：取105 mL 95%乙醇溶液加去離子水至1 000 mL配成10%乙醇溶液；高醇溶液食品模擬體系（T2）：取526 mL 95%乙醇溶液，添加去離子水定容至1 000 mL；水分活度為0.6～0.7的食品模擬體系（T3）：取600 mL丙三醇加去離子水至1 000 mL配成60%甘油溶液；脂肪類食品模擬體系（T4）：1 000 mL正己烷。

1.3.8 指標的測定

1.3.8.1 JS25噬菌體包埋率[26]測定

取5 g濕微球加入45 mL微球破解液中，室溫下溶解3 h后，檢測破解液中噬菌體效價，按照下式計算包埋率。對于干燥后的微球，需先在SM緩沖液中37 ℃水化15 min后再破解。

1.3.8.2 粒徑測定[27]

采用馬爾文納米粒度基于動態(tài)光散射原理測定儀測定JS25噬菌體微囊粉的平均粒徑。

1.3.8.3 掃描電子顯微鏡觀察[28]

取適量JS25噬菌體微囊粉，將其用膠黏附于鋁制的樣品載物臺上，再放入真空噴涂儀內進行蒸鍍Au/Pd，最終于JSM-6510掃描電子顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.3.8.4 釋放率測定[29]

JS25噬菌體微囊粉釋放率為不同模擬液中JS25噬菌體效價與微球裂解液中JS25噬菌體效價的比值。

1.4 數據統計

所有數據利用Microsoft Excel 2010進行統計處理，用SAS 9.2進行ANOVA分析，不同平均值之間利用LSD（least-significant difference）法進行差異顯著性檢驗（ ±s，n=3）。

2 結果與分析

2.1 不同處理條件對JS25噬菌體微囊粉包埋率的影響

圖1 不同處理條件對包埋率的影響Fig.1 Effects of different conditions on microencapsulation eff i ciency

從圖1可以看出，隨著二者添加量的增加，JS25噬菌體的包埋率均呈現顯著的（P＜0.05）先增加后降低的趨勢。對于海藻酸鈉，當添加量在2.5～4.5 g/100 mL時，噬菌體有較高的包埋率。過高的添加量（大于5.0 g/100 mL）增加了溶液凝膠的黏稠度，造成膠體結塊，從而降低了噬菌體的包埋率；而過低的添加量（低于2.5 g/100 mL）則降低了膠體的黏稠度，從而不能完成對噬菌體的包埋。而對于CaCl2，當添加量在1.5～3.5 g/100 mL時，噬菌體有較高的包埋率；而過低的添加量不能夠完成對膠體顆粒的硬化，過高添加量則可能會導致膠體微球破解，從而降低了JS25噬菌體的包埋率。

2.2 JS25噬菌體微囊粉制備工藝優(yōu)化結果

如表2所示，海藻酸鈉及CaCl2不同添加量對微囊粉的包埋率有顯著的影響（P＜0.05）。

表2 響應面試驗設計與結果Table2 Central composite design with experimental values of microencapsulation eff i ciency

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中響應面試驗數據進行二次多項式回歸分析，建立包埋率對試驗中涉及的2 個因素變量的二次多項式的回歸方程：Y=-151.98+100.87X1+40.62X2-3.42X1X2-12.39X12-5.46X2

由圖2可知，2 個因素對JS25噬菌體的包埋率有明顯的交互作用，并且在試驗研究范圍內，單一因素的臨界值（最適添加量）隨另外因素的增加呈先升高后降低的趨勢，與單因素試驗結果相似。

圖2 海藻酸鈉和CaCl2添加量交互作用結果Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of sodium alginate and CaCl2 on microencapsulation eff i ciency

以JS25噬菌體包埋率最大值為目標值，對構建的二次回歸方程進行優(yōu)化后得到，在海藻酸鈉添加量3.72 g/100 mL、CaCl2添加量2.55 g/100 mL條件下，JS25噬菌體存在最大的包埋率為87.43%，以該條件進行驗證實驗得到，JS25噬菌體包埋率為（88.38±0.38）%，與理論值相對誤差小于5%。說明該工藝準確可靠，可以用于JS25噬菌體微囊粉的生產加工。

2.3 JS25噬菌體微囊粉結構表征結果

2.3.1 掃描電子顯微鏡結果

圖3 掃描電子顯微鏡結果Fig.3 Scanning electron micrographs of sodium alginate and microcapsules

為了進一步表征JS25噬菌體的顆粒形態(tài)，通過掃描電子顯微鏡對JS25噬菌體微囊粉（圖3b）及海藻酸鈉凝膠（圖3a）進行表征后可以看出，微囊粉呈均勻的顆粒狀分布，而海藻酸鈉膠體大致呈網狀、塊狀結構。說明該方法能有效制備JS25噬菌體微囊粉，并且微囊顆粒分布均勻。

2.3.2 JS25噬菌體微囊粉粒徑分布

圖4 JS25噬菌體粒徑分布Fig.4 Size distribution of microcapsules

由圖4可知，微囊粉粒徑范圍在20～90 μm之間，且呈正態(tài)分布。其中粒徑范圍在30～50 μm之間的微囊粉約占60%。說明實驗得到的JS25噬菌體微囊粉顆粒均勻，該工藝能有效、均勻地完成對噬菌體的包埋。

2.4 JS25噬菌體微囊粉的穩(wěn)定性結果

圖5 JS25噬菌體微囊粉穩(wěn)定性結果Fig.5 Stability of microcapsules

從圖5可以看出，在4 ℃時，浮游態(tài)噬菌體在貯藏1 d時，效價從7.8（lg（PFU/g））迅速降至0（lg（PFU/g）），而JS25噬菌體微囊粉在貯藏35 d后，效價發(fā)生輕微降低，但是無顯著差異（P＞0.05）。在20 ℃時，浮游態(tài)噬菌體在6 h后即失活，而噬菌體微囊粉在1 d后呈略微的降低，在貯藏35 d后，效價從6.81（lg（PFU/g））降低至5.41（lg（PFU/g）），僅下降1.4（lg（PFU/g））。說明微囊粉能有效地完成對JS25噬菌體的包埋，并且可維持噬菌體活性至35 d。

2.5 食品模擬體系中JS25噬菌體微囊粉釋放結果

釋放性能是載藥微囊粉的重要性能指標，既可以保持活性物質在體系中不斷釋放，也可以提高活性物質的穩(wěn)定性，從而達到長效作用[30]。從圖6可以看出，在不同種類的食品模擬體系中，JS25噬菌體釋放規(guī)律相同，在0～5 min均能夠快速地釋放，在釋放5～8 min后變緩并逐漸穩(wěn)定。具體表現為：JS25噬菌體在T1體系中有最快的釋放速度，在體系中2 min后釋放率可達79.35%，隨著時間的繼續(xù)延長，釋放率逐漸增加，在6 min后達到98%，隨后無顯著差異（P＞0.05）。另外，JS25噬菌體在T4體系中的釋放率在5 min后趨于穩(wěn)定，可達到91%；在T3體系中在6 min時趨于穩(wěn)定，釋放率可達到84%；在T2體系中釋放率最低，在7 min后逐漸穩(wěn)定，釋放率可達75%。

對圖6不同食品模擬體系中JS25噬菌體的釋放曲線進行數學釋放模型擬合，擬合所得方程對應的決定系數R2見表3。從表3可以看出，在T1、T2、T4體系中，噬菌體的釋放行為符合一級動力學模型y=a×（1-exp（-bx）），且R2均大于0.9；而在T3體系中，噬菌體的釋放行為符合Higuchi模型。綜合上述結果可以看出，JS25噬菌體微囊粉在不同食品模擬體系中均有理想的釋放效果，并且釋放率均高于75%。

圖6 食品模擬體系中JS25噬菌體釋放曲線Fig.6 Release curve of microencapsulated phage in food simulant systems

表3 JS25噬菌體釋放動力學模型擬合Table3 Kinetic model equations and determination coeff i cients for release of microencapsulated phage

3 結論與討論

海藻酸鈉和CaCl2組成的體系能有效地構建JS25噬菌體微囊粉，表現為隨著二者添加量的增加，JS25噬菌體的包埋率呈顯著的（P＜0.05）先增加后降低的趨勢，并且二者對包埋率有顯著的交互作用；通過響應面試驗優(yōu)化得到海藻酸鈉和CaCl2添加量分別為3.72、2.55 g/100 mL時，JS25噬菌體包埋率可達到最大值88.38%。實驗得到的JS25噬菌體微囊粉有穩(wěn)定的顆粒結構，且顆粒粒徑在20～90 μm之間呈正態(tài)分布。另外，該狀態(tài)的噬菌體穩(wěn)定性顯著增加，表現為與浮游態(tài)噬菌體失活相比，在4 ℃及20 ℃條件下噬菌體微囊粉貯藏35 d也有較高的效價。JS25噬菌體微囊粉在不同的食品模擬體系中均迅速釋放并逐漸穩(wěn)定，在不同體系中釋放8 min后，釋放率可達到75%以上；并且其釋放規(guī)律符合一級動力學模型及Higuchi模型。說明該工藝可以用于對JS25噬菌體的微囊化包埋，以提高JS25噬菌體的穩(wěn)定性。

JS25噬菌體作為一種天然的殺菌劑，廣泛應用于食品保鮮中，可增強食品的安全性和延長食品的保質期，但是天然噬菌體大多為浮游態(tài)，極易失活，從而限制了其在食品保鮮加工中的應用。目前，采用海藻酸鹽固定天然活性成分已經取得了廣泛應用，Diamante等[31]通過海藻酸鹽成功包埋了乳酸鏈球菌，并顯著提高了其穩(wěn)定性；Prisco等[32]通過微囊化技術固定了Lactobacillus reuteri DSM 17938益生菌，增強了其在食物和腸道中的穩(wěn)定性。但是，在不同的研究成果中得到的微囊粉形態(tài)卻存在較大的差異，從掃描電子顯微鏡結果可以看出，通過海藻酸鈉-CaCl2體系可以將噬菌體包埋為微米級別的微囊粉，微囊粉呈不規(guī)則的圓球狀，可能是因為海藻酸鈉在擠出階段或在CaCl2溶液中硬化過程中導致，但是也有研究報道可能是由于噬菌體表面和海藻酸鈉之間的相互作用導致[10]。另外，在20 ℃條件下，與浮游態(tài)噬菌體在6 h即失活相比，微囊粉態(tài)噬菌體在貯藏35 d僅失活15.66%，說明微囊粉能有效地實現對JS25噬菌體的包埋，并且可維持噬菌體活性至35 d以上。JS25噬菌體微囊粉在不同液態(tài)食品模擬液中的釋放率存在差異，可能是由于液態(tài)食品中的水分活度及黏度不同導致。

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