溶氧和無機(jī)鹽控制對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響

◎ 陳立平，朱傳廣，孫海東

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.長(zhǎng)春大成實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000）

L-色氨酸是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)所必需的8種氨基酸之一，以游離態(tài)或結(jié)合態(tài)存在于生物體中[1]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料等方面。在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育與新陳代謝中扮演著舉足輕重的角色。早期，多采用化學(xué)合成法[2]和蛋白質(zhì)水解法[3]來實(shí)現(xiàn)色氨酸的工業(yè)生產(chǎn)制備，但存在原料昂貴、轉(zhuǎn)化率低等問題，因而未能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模推廣。

目前，在工業(yè)生產(chǎn)中，主要采用微生物發(fā)酵法來制備L-色氨酸[4-5]，此外還以葡萄糖、甘蔗糖蜜為原料，再通過優(yōu)良的色氨酸菌株誘導(dǎo)生成色氨酸的方法，這種方法被稱為直接發(fā)酵法。由于無法直接從自然界獲取色氨酸，且其合成途徑工藝復(fù)雜，因此可以利用誘變或基因重組的方法獲得色氨酸。在實(shí)驗(yàn)過程中，由于發(fā)酵過程中其他酸的影響，使色氨酸的合成受到抑制，因此，抑制其他酸的產(chǎn)生，使之向合成色氨酸途徑發(fā)展，對(duì)大生產(chǎn)有重大意義。

大腸桿菌被大量應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域[6]，這主要?dú)w功于大腸桿菌易于培養(yǎng)、發(fā)酵周期短的特點(diǎn)，更重要的是大腸桿菌的遺傳背景清晰，便于誘變過程中對(duì)基因的改造。本文在溶氧20%～30%的環(huán)境條件下，針對(duì)大腸桿菌進(jìn)行不同濃度無機(jī)鹽的培養(yǎng)試驗(yàn)、觀察、記錄，從而得到產(chǎn)量最優(yōu)的色氨酸菌株。

1　材料與方法

1.1　菌種

大腸桿菌E.coliDJ-4322，由大成集團(tuán)氨基酸菌種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2　儀器

生物顯微鏡（奧林巴斯公司）、TDL-80-2B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、722分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）、3L自動(dòng)控制發(fā)酵罐（德國(guó)）、電子臺(tái)秤[梅特勒-托利（常州）測(cè)量有限公司]、SBA-40D生物傳感分析儀（山東科學(xué)院生物研究所）。

1.3　基礎(chǔ)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

1.3.1種子罐培養(yǎng)基

葡萄糖 20.0 g/L、(NH4)2SO410.0 g/L、MgSO4·7H2O 5.0 g/L、FeSO4·7H2O 15.0 g/L、KH2PO41.5 g/L、MnSO4·H2O 1 g/L、酵母浸粉15.0 g/L、檸檬酸鈉0.5 g/L、維生素B1100 mg、121 ℃滅菌20 min。

1.3.2培養(yǎng)方法

經(jīng)菌種室預(yù)培養(yǎng)的菌種接入上述培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為400～800 r/min，溫度控制在35 ℃，通過自動(dòng)補(bǔ)充氨氣使pH保持在6.9，培養(yǎng)15 h后將接入發(fā)酵大罐。

1.3.3基礎(chǔ)培養(yǎng)基

KH2PO47.5 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、(NH4)2SO41.6 g/L、檸檬酸鈉2 g/L、葡萄糖7.5 g/L、微量元素液2 mL/L，121 ℃滅菌 15 min。

微量元素液：CoCl2·H2O 0.75g/L、CuSO4·5H2O 2.5 g/L、FeSO4·7H2O25 g/L、甜菜堿0.4 g/L、酵母浸粉1 g/L，pH6.7～6.9。121 ℃滅菌15 min。

1.3.4培養(yǎng)方法

取上述種子發(fā)酵液的10%菌體接入3 L發(fā)酵罐中，空氣量1 L/min，轉(zhuǎn)速800～1 000 r/min，培養(yǎng)溫度35 ℃，自動(dòng)補(bǔ)充氨氣，pH控制在6.8，隨著菌體生長(zhǎng)而初糖耗盡時(shí)，向罐體內(nèi)流加葡萄糖，慢慢調(diào)控使溶氧在20%～30%。

1.4　測(cè)定方法

1.4.1酸濃度測(cè)定

（1）L-色氨酸的測(cè)定方法。首先將發(fā)酵液置于離心機(jī)中以3 000 r/min的速度離心10 min，隨后稀釋到適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，稱取1 mL稀釋過的發(fā)酵液和9 mL的對(duì)二甲氨基苯甲醛儲(chǔ)備溶液，將兩者混合并移入試管，60 ℃水浴15 min，然后在溶液中滴入0.05 mL的0.5%亞硝酸鈉溶液，混合均勻之后再在60 ℃的水浴環(huán)境條件下靜置5 min，完畢之后取出冷卻，靜置10 min。采用硫酸溶液（不含對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色劑）作為樣品空白，在593 nm處用1 cm比色皿測(cè)定吸光值。利用L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行系列溶液的配制，以相同的方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而定量求出L-色氨酸的產(chǎn)量。

（2）紙板層析法。將層析板根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)裁出合適的寬度，在距離底邊2～3 cm處用鉛筆劃出一條直線，在直線上根據(jù)樣品數(shù)點(diǎn)上已稀釋好的樣品，吹干后放入自制的展開劑中走樣，行至析板頂部后取出放入烘箱中，5 min后取出，根據(jù)顯色斑點(diǎn)深淺與標(biāo)樣對(duì)比計(jì)數(shù)。展開的時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則烘干的樣點(diǎn)會(huì)模糊不清。

1.4.2pH測(cè)定

線上測(cè)定和線下校正。

1.4.3溶氧測(cè)定

采用溶氧和光氧電極混合測(cè)定。

1.4.4菌液濃度測(cè)定

波長(zhǎng)設(shè)定為600 nm，稀釋后的菌液放入722可見分光光度計(jì)中測(cè)數(shù)。

1.4.5葡萄糖濃度的測(cè)定

將葡萄糖用蒸餾水稀釋一定濃度后，采用生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1　溶氧控制對(duì)菌液濃度、乙酸抑制和L-色氨酸合成的影響

氨基酸生產(chǎn)菌是一種需氧菌，需要在無菌空氣條件下才能進(jìn)行生物體的繁殖以及所需代謝產(chǎn)物的積累[7]，因此，合理地設(shè)置發(fā)酵液中溶氧濃度參數(shù)[8]將成為氨基酸發(fā)酵工藝中的重要因素，并且適當(dāng)?shù)墓┭趿靠梢越档椭谱鞒杀荆?jié)約能源[9]。

更重要的是，發(fā)酵液中的溶氧量會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累，從而影響最終的產(chǎn)量[10]，這是因?yàn)槲⑸锩傅幕钚约按x途徑會(huì)隨著溶氧濃度的變化而發(fā)生一定的變化。因此，在微生物的發(fā)酵過程中，溶氧量對(duì)菌體的生長(zhǎng)有很大的影響，且溶氧的控制不是一成不變的，本實(shí)驗(yàn)是控制不同的溶氧來觀察菌體的生長(zhǎng)情況。

每組實(shí)驗(yàn)均采用6個(gè)3 L發(fā)酵罐，每2個(gè)為平行樣，最終取平均值，記錄對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，保證培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、接種量相同，通過改變通氧量來觀察實(shí)驗(yàn)效果。在實(shí)驗(yàn)初糖耗盡后，開始流加濃糖，使溶氧分別控制在10%～20%、20%～30%、30%～40%，來記錄對(duì)菌液濃度和酸的影響。如圖1所示，為當(dāng)溶氧控制在10%～20%時(shí)，溶氧過低，L-色氨酸生產(chǎn)途徑受到抑制，乙酸大量生成，至使菌體濃度在短時(shí)間內(nèi)降低，色氨酸也不斷下降。當(dāng)溶氧控制在30%～40%時(shí)，雖乙酸積累不是很多，但會(huì)產(chǎn)生很多色素，使色氨酸停止合成而降低，雖然菌體濃度較高，但是沒有最終合成產(chǎn)物。當(dāng)溶氧控制在20%～30%時(shí)，乙酸產(chǎn)量最少且色氨酸產(chǎn)量較高，因此20%～30%的溶氧范圍為最佳的實(shí)驗(yàn)條件。

圖1　不同溶氧濃度對(duì)生產(chǎn)菌體濃度、乙酸和L-色氨酸產(chǎn)量的影響圖

2.2　無機(jī)鹽濃度對(duì)菌體濃度、乙酸產(chǎn)量和L-色氨酸產(chǎn)量的影響

在實(shí)驗(yàn)過程中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)當(dāng)色氨酸達(dá)到一定產(chǎn)量時(shí)，色氨酸的積累就會(huì)停滯或下降，此過程大大增加了控制的復(fù)雜性及成本支出，即使達(dá)到最高值，各實(shí)驗(yàn)最終色氨酸產(chǎn)量也都相近。保持葡萄糖流加并控制溶氧在20%～30%狀態(tài)，且其他控制參數(shù)不變，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此菌種通過改變無機(jī)鹽濃度會(huì)使產(chǎn)量有所改變。無機(jī)鹽雖用量不大，但如果在合成色氨酸過程中無機(jī)鹽的補(bǔ)充跟不上，就會(huì)影響產(chǎn)量。因此，通過實(shí)驗(yàn)不同無機(jī)鹽濃度來實(shí)現(xiàn)色氨酸產(chǎn)量的提高。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，將無機(jī)鹽七水硫酸鋅分別調(diào)為基礎(chǔ)的1.17倍、0.79倍、0.40倍，一水硫酸錳調(diào)整為原來的1.13倍。結(jié)果如圖2所示，隨著無機(jī)鹽濃度的調(diào)整，色氨酸的產(chǎn)量發(fā)生了很大變化，當(dāng)濃度調(diào)整到0.40倍時(shí)，酸的產(chǎn)量達(dá)到一定程度后不再產(chǎn)酸，之后反而下降，當(dāng)濃度達(dá)到1.17倍時(shí)，產(chǎn)量有所增加，但當(dāng)降到0.79倍時(shí)，乙酸產(chǎn)量最低，且色氨酸量會(huì)達(dá)到最高，所以采用原來培養(yǎng)基的0.79倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2　不同無機(jī)鹽濃度對(duì)菌體濃度、L-色氨酸和乙酸的產(chǎn)量的影響圖

3　結(jié)果與討論

（1）色氨酸初始發(fā)酵時(shí)，菌體處于起步生長(zhǎng)階段，對(duì)氧的需求并不是很大，但隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，菌體生長(zhǎng)加快，繁殖加速，耗氧不斷增加，此時(shí)應(yīng)及時(shí)調(diào)整通氧量，保持菌體的正常需求。當(dāng)菌體生長(zhǎng)到一定階段時(shí)，應(yīng)保持通氧量為20%～30%狀態(tài)，過高或過低都不利于菌體的生長(zhǎng)。有文獻(xiàn)[11]表明，過高的溶氧水平會(huì)使菌體發(fā)酵過程中產(chǎn)生新生氧，其分離出的O2-和OH-將對(duì)細(xì)胞的組分進(jìn)行一定的破壞，并且會(huì)消耗大量的能量，產(chǎn)生許多泡沫。雖然不會(huì)積累大量的乙酸，但會(huì)形成較多的色素，使色氨酸合成停止，糖酸轉(zhuǎn)化率降低。若溶氧過低，發(fā)酵菌體生長(zhǎng)繁殖會(huì)受到抑制，菌種提前老化甚至自溶，還可生成許多代謝副產(chǎn)物，如乙酸的大量積累，在很短時(shí)間內(nèi)菌體濃度降低，色氨酸產(chǎn)量下降。

（2）發(fā)酵菌體雖然無機(jī)鹽量需要不是很多，但是無機(jī)鹽用量的多少卻影響著菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成，對(duì)實(shí)驗(yàn)有至關(guān)重要的作用。加入高無機(jī)鹽會(huì)使乙酸的合成延后，如圖2中所示，當(dāng)無機(jī)鹽量提到原來的1.17倍時(shí)，乙酸合成稍有延后，但很快就會(huì)加速合成。從而抑制L-色氨酸的合成，降低酸的產(chǎn)量。當(dāng)無機(jī)鹽過低時(shí)，當(dāng)達(dá)到原來的0.40倍時(shí)，乙酸的量加速合成，同樣達(dá)不到目的。因此，合理控制無機(jī)鹽的量有利于色氨酸的合成。

上述實(shí)驗(yàn)是無機(jī)鹽的部分組合實(shí)驗(yàn)，接下來將繼續(xù)研究各個(gè)不同無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酸的影響，以便找到更優(yōu)的無機(jī)鹽濃度，達(dá)到更高的色氨酸產(chǎn)量。

（3）目前，國(guó)外生產(chǎn)L-色氨酸的企業(yè)也只有少數(shù)幾家，大多集中在歐美等國(guó)家，且由于每年L-色氨酸需求量不斷增加，但L-色氨酸的產(chǎn)量卻沒有增加，我國(guó)由于受到技術(shù)的限制，生產(chǎn)能力不及國(guó)外，多依賴于國(guó)外進(jìn)口。

L-色氨酸具有較大市場(chǎng)潛能，隨著人們對(duì)L-色氨酸的重視，不僅將其應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料和食品，還將應(yīng)用于化妝品等。目前國(guó)內(nèi)由于生產(chǎn)色氨酸的技術(shù)工藝復(fù)雜且成本較高[12]，因而只有少數(shù)廠家能進(jìn)行色氨酸的生產(chǎn)，這將導(dǎo)致色氨酸產(chǎn)量較低，因此需要更多的研發(fā)人員致力于L-色氨酸的生產(chǎn)研究，不斷完善其生產(chǎn)工藝，為我國(guó)的L-色氨酸生產(chǎn)打開更廣闊的領(lǐng)域。