鱷魚肉多肽的抗氧化性研究

◎ 劉雅頎，尹曉清，喻志林，郭曉雙

（1.湖北瑞邦生物科技有限公司，湖北 荊州 434000；2.北京百生康健康產業有限公司，北京 100020）

鱷魚有“活化石”之稱，具有壽命最長、免疫力最強、終身不患癌癥、骨頭最硬的特征。鱷魚的醫藥價值遠在犀角、虎骨之上，在醫學上享有“動物黃金”之美譽，因此國內外對其研究日益加深[1-2]。目前。已有許多學者利用生物酶解技術以沙丁魚、油菜籽、鰱魚等多種原料制備了許多抗氧化活性多肽[3-5]。據研究報道，鱷魚肉中含人體8種必需氨基酸，是優勢的蛋白資源[6]。除此之外，抗氧化肽是目前國內外研究較多的一種生物活性肽，安全、穩定、高效[7-8]。目前國內外對鱷魚的研究主要側重于養殖方面，在對鱷魚肉多肽抗氧化性研究方面還沒有系統性的報道。Zhong[9]只是研究報道相對分子質量＜1 000組分的自由基清除能力較強。

本研究采用0.8%堿性蛋白酶對鱷魚肉進行酶解，通過減少相對分子質量的大小，進行抗氧化活性研究，探討鱷魚肽的生物活性變化，為功能性鱷魚肉蛋白產物的開發利用提供一定理論基礎和應用基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

鱷魚肉由北京百生康提供，于-18 ℃冷凍保存；1,1-二苯基-2-苦基腙肼（DPPH），購于Sigma公司，分析級；硫酸亞鐵、三氯乙酸、無水乙醇、濃硝酸、磷酸緩沖液、雙氧水、鄰非羅啉、三氯化鐵，購于中國國藥，分析級；甲醇、乙腈、氨基酸標準品購于中國國藥，色譜級；堿性蛋白酶 購于諾維信，食品級。

高效液相色譜儀LC-20AT，C18column （250 mm×4.6 mm），日本島津；紫外分光光度儀mini-1240（Shimadzu公司）；生化培養箱SPX-250B-Z（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.2　實驗方法

1.2.1鱷魚肉漿液制備

將鱷魚肉洗凈后，準確稱重，切小塊加入2倍水，放入均質機中勻漿。

1.2.2鱷魚多肽液制備

向鱷魚肉漿液中加入鱷魚肉質量0.8%的堿性蛋白酶，持續酶解6 h。酶解條件為60 ℃、pH 9.0（加NaHCO3調節pH）。每隔0.5 h取樣，高溫滅酶，過濾，得到不同酶解時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h和4.5 h）的酶解鱷魚多肽液。

1.2.3鱷魚脫色多肽液制備

將鱷魚多肽液準確量取體積V，加入鱷魚多肽液質量2%的活性炭，在50 ℃條件下脫色2 h。

1.2.4相對分子質量測定

酶解物相對分子質量分布的測定采用凝膠層析法[10-11]，由Sephadex G-15柱(φ1.1 cm×50 cm)分析檢測。

1.2.5抗氧化性測定

1.2.5.1DPPH自由基清除能力測定

利用DPPH醇溶液呈紫色并在517 nm處有強吸收的特點定量測定鱷魚多肽制備過程中，DPPH清除能力的變化。將1 mg的DPPH溶于無水乙醇，定容至10 mL，配制成0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。取1 mL固形物含量為2%的樣品溶液（鱷魚肉漿、鱷魚酶解液和鱷魚脫色液）和4 mL的DPPH醇溶液于棕色帶塞試管中，均勻震蕩，在室溫下避光反應30 min后立即在517 nm處測定其吸光值As。再取1 mL固形物含量為2%樣品溶液和4 mL無水乙醇溶液，均勻混合在相同條件下反應，測定吸光值A0。取1 mL蒸餾水和4 mL的DPPH醇溶液均勻混合在相同條件下反應，測定吸光值Ac。按照公式（1）計算鱷魚酶解不同時間條件下的抗氧化性變化。

式（1）中，A0為空白組吸光值；Ac為對照組吸光值；As為樣品測定值。

1.2.5.2羥基自由基（OH）清除能力測定

利用Fenton反應將1.0 mL的7.5 mmol/L鄰菲羅啉與2.0 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液充分混勻。再加入0.1% H2O2溶液，加入1 mL的質量濃度2%的樣品溶液震蕩均勻后置于37 ℃水浴中反應60 min，在536 nm處測定其吸光度As。再用1 mL的蒸餾水代替樣品做空白對照A0。用1 mL蒸餾水代替H2O2，1 mL蒸餾水代替樣品，測定吸光值Ac。

式（2）中，A0為空白組吸光值；Ac為對照組吸光值；As為樣品測定值。

1.2.5.3超氧陰離子自由基清除能力測定

反應顯色體系：4.5 mL pH為8.34的磷酸緩沖液，1.2 mL蒸餾水在25 ℃下保溫30 min，加入0.3 mL 25℃的鄰苯三酚，4 min后立即在325 nm下測定吸光值Az。另將0.5 mL樣品、0.7 mL蒸餾水、4.5 mL的磷酸緩沖液在25 ℃下保溫30 min，加入0.3 mL 25 ℃的鄰苯三酚，在4 min后立即在325 nm下測定吸光值As。

式（3）中，Az為4 min內鄰苯三酚的自氧化吸光值；As樣品氧化后吸光值。

2　結果與討論

2.1　DPPH自由基清除能力

經測定，鱷魚肉漿清除自由基DPPH能力為48.68%，低于部分鱷魚肽。如圖1所示，不同酶解程度的鱷魚肽相對分子質量不同，氨基酸的組成不同清除自由基DPPH能力不同。隨著酶解程度的不斷加深，鱷魚蛋白不斷被水解成多肽、氨基酸疏水基不斷暴露，相對分子質量變小。

圖1　鱷魚肉酶解時間對多肽液DPPH自由基清除能力和相對分子質量的影響圖

在堿性蛋白酶酶解2 h時，鱷魚肽分子量為2 200時，鱷魚肽清除自由基DPPH的能力最強，達到85.4%，遠遠高于鱷魚肉漿清除自由基能力46.68%。說明酶解蛋白成小分子肽有利于對自由基DPPH清除能力的提高，有助于鱷魚功效性提升。但繼續酶解鱷魚蛋白，鱷魚蛋白繼續水解成更小分子，其清除自由基DPPH能力降低。這一趨勢說明鱷魚肽在一定分子量范圍內，多肽鏈具有較強的清除自由基DPPH能力。

2.2　羥基自由基（OH）清除能力

如圖2所示，酶解時間越長，鱷魚肉多肽液中的相對分子質量逐漸減小，其羥基自由基清除能力逐漸增加到平穩趨勢，考慮到鱷魚肉多肽液的活性，發現酶解時間在2 h時，在相對分子質量為2 200時，羥基自由基的清除能力高達83.479%，與其DPPH自由基清除能力相呼應，說明相對分子質量過低，酶解時間過長，其鱷魚肉多肽液的生物活性反而不是最高。

圖2　鱷魚肉酶解時間對多肽液羥基自由基清除能力和相對分子質量的影響圖

2.3　超氧陰離子自由基清除能力

如圖3所示，酶解時間越長，鱷魚肉多肽液相對分子質量逐漸減小，其超氧陰離子自由基清除能力逐漸增加，考慮到鱷魚肉多肽液的活性，發現酶解時間在2 h時，在相對分子質量為2 200時，超氧陰離子自由基的清除能力高達75.976%，但是都低于DPPH和OH自由基的清除能力，高于其他魚肉自由基清除能力，與其DPPH自由基、羥基自由基清除能力相呼應，說明相對分子質量過低，酶解時間過長，其鱷魚肉多肽液的生物活性反而不是最高。

圖3　鱷魚肉酶解時間對多肽液超氧陰離子自由基清除能力和相對分子質量的影響圖

3　結論

經過堿性蛋白酶酶解后的鱷魚肉多肽液對DPPH、OH和超氧陰離子自由基的清除能力不同，且酶解時間對其影響也是不同程度的變化的，而酶解時間過長會導致相對分子質量的大大減小，導致多肽含量過高，生物活性降低明顯。當酶解時間為2 h時，相對分子質量為2 200時，鱷魚肉多肽液對DPPH、OH和超氧陰離子自由基的清除能力分別是85.4%、83.479%、75.976%，表現出較好的抗氧化性，具備作為天然抗氧化劑的潛力。