用食品安全級載體
——殼聚糖固定化乳糖酶條件的優(yōu)化

付 雪，隋 琳，吳巧麗，谷 偉，錢 方

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

0 引言

乳糖酶即β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶（β-D-galactoside galacto-hydrolase），是一類催化特殊類型糖苷鍵-β-半乳糖苷類化合物中β-半乳糖苷鍵發(fā)生水解斷裂的酶[1]。它廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，用乳糖酶水解牛乳中乳糖可以滿足乳糖不適癥患者需要，還可提高乳制品甜度，減少甜味劑用量；可防止冷凍乳制品易結(jié)晶析出；用乳糖水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿、食品添加劑等[2-6]。但由于乳糖酶成本過高等因素制約了其應(yīng)用。而固定化乳糖酶可以反復(fù)使用，且能縮短時間、節(jié)約成本，同時固定化乳糖酶對酸、堿有較強的耐受力，熱穩(wěn)定性也較好。國外已有相當(dāng)規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)固定化乳糖酶[7]。殼聚糖是由廣泛存在于自然界的幾丁質(zhì)脫乙酰得到的一種天然高分子生物材料，因其相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)所關(guān)注，在很多領(lǐng)域已經(jīng)取得了進展，而在固定化酶并保持酶活性方面有獨特優(yōu)點。2004年，毛跟年等人[8]研究了強化海藻酸鈣固定化β-半乳糖苷酶的方法及固定化酶的性質(zhì)，并用于制備低聚半乳糖。2006年，潘曉亞等人[9]以明膠為載體包埋固定乳糖酶，優(yōu)化了固定化條件。2011年，錢婷婷等人[10]用改性磁性殼聚糖微球固定乳糖酶。與前人研究不同的是試驗考慮到食品安全選擇食品安全級的殼聚糖為載體固定乳糖酶，研究其固定化酶的優(yōu)化條件。

1 試驗方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥90%）食品級，大連鑫蝶甲殼素有限公司提供；乳糖酶（3 000 L HP-G），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司提供；血糖測定試劑盒，保定長城臨床試劑公司提供；鄰硝基酚（ONP）、鄰硝基酚-β-半乳糖苷（ONPG）、戊二醛、磷酸氫二鉀等。

1.2 儀器

pHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品；722型光柵可見分光光度計，山東高密彩虹分析儀器有限公司產(chǎn)品；UV-1900型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 方法

（1）殼聚糖載體制備[11]。將質(zhì)量濃度20.0 g/L殼聚糖溶液滴入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%NaOH和30%甲醇的凝結(jié)液中，液滴剛滴入凝結(jié)液時不攪拌，即得殼聚糖載體，取殼聚糖載體0.2 g進行固定化條件研究。

（2） 乳糖酶活力測定。采用ONPG法[12]。

（3） 酶活力回收率[13]。

式中：U1——固定化酶總活力，U/g；

U2——加入游離酶總活力，U/g。

（4）蛋白含量的測定。采用紫外吸收法[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化順序確定

酶固定化方法分2種：一種是先將載體與酶作用，再用戊二醛交聯(lián)（即先固定后交聯(lián)）；另一種是載體先經(jīng)戊二醛活化后，再與酶作用（即先交聯(lián)后固定）。為達(dá)到更好的固定化乳糖酶效果，研究了固定化順序?qū)θ樘敲富盍Φ挠绊憽?/p>

固定化順序?qū)潭ɑЧ挠绊懸妶D1。

圖1 固定化順序?qū)潭ɑЧ挠绊?/p>

由圖1可知，先交聯(lián)后固定法制得固定化乳糖酶活力為0.495 U/g，而先固定后交聯(lián)法制得固定化乳糖酶活力僅為0.018 U/g?？梢?，載體經(jīng)過戊二醛交聯(lián)活化后可以與酶牢固結(jié)合。

2.2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定

戊二醛是雙官能團試劑，既是交聯(lián)劑又是蛋白質(zhì)變性劑[15]。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時，沒能將足夠的酶交聯(lián)到載體上；而戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)高時，戊二醛作為變性劑又能使酶失活。所以，研究戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶活力影響，以期達(dá)到最高固定化酶活力。

戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響見圖2。

圖2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響

由圖2可知，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%時，固定化乳糖酶活力最高，乳糖酶活力回收率為2.08%。當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.4%時，殼聚糖載體上活性基團相對較少，固定化乳糖酶活力較低，殼聚糖分子中被活化氨基數(shù)量隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加，故固定化乳糖酶活力也升高；當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.4%時，殼聚糖載體上形成過多的活性醛基，導(dǎo)致酶分子與載體之間形成多點結(jié)合，產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)障礙，使酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，固定化乳糖酶活力則有所下降。因此，選擇戊二醛適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%，此時固定化酶活力最大。

2.3 戊二醛用量確定

戊二醛用量對固定化酶活力的影響見圖3。

圖3 戊二醛用量對固定化酶活力的影響

由圖3可知，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%戊二醛溶液用量為1.5 mL時，固定化乳糖酶活力最高。當(dāng)戊二醛用量少于1.5 mL時，固定化乳糖酶活力隨著戊二醛用量的增加而升高；當(dāng)高于1.5 mL時，固定隨著戊二醛用量的增加而降低。因此，選擇戊二醛適宜用量為1.5 mL，此時固定化酶活力最大。

2.4 交聯(lián)溫度確定

交聯(lián)溫度影響載體的活化程度，也直接影響載體與酶的固定。

交聯(lián)溫度對固定化酶活力的影響見圖4。

圖4 交聯(lián)溫度對固定化酶活力的影響

由圖4可知，4℃低溫時固定化乳糖酶活力較低，說明低溫不利于乳糖酶與殼聚糖載體的交聯(lián)；隨著交聯(lián)溫度的升高，固定化乳糖酶活力逐漸增大；當(dāng)交聯(lián)溫度達(dá)到30℃時，固定化乳糖酶活力最高；當(dāng)交聯(lián)溫度高于30℃時，固定化乳糖酶活力開始迅速下降，這可能是由于溫度升高使得游離乳糖酶的活力有所降低。因此，選擇30℃作為交聯(lián)溫度。

2.5 交聯(lián)時間確定

交聯(lián)時間即戊二醛與殼聚糖載體接觸時間，也是載體被活化的時間，也影響固定化酶活力。

交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響見圖5。

圖5 交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響

由圖5可知，固定化乳糖酶活力隨著交聯(lián)時間的延長而增大；當(dāng)交聯(lián)時間達(dá)到16 h時，固定化乳糖酶活力最高；交聯(lián)時間超過16 h，固定化乳糖酶活力迅速下降，24 h時酶活下降了10%?？赡苡捎谖於γ赣幸欢ㄗ冃宰饔茫S著交聯(lián)時間延長，固定化乳糖酶活力有所下降。因此選擇交聯(lián)時間為16 h。

2.6 交聯(lián)pH值確定

酶分子本身帶有許多氨基酸殘基，氨基酸殘基包括酸性和堿性，所以pH值變化會影響殘基側(cè)鏈基團的解離狀態(tài)，從而影響底物的結(jié)合和催化反應(yīng)。

交聯(lián)pH值對固定化酶活力的影響見圖6。

圖6 交聯(lián)pH值對固定化酶活力的影響

由圖6可知，固定化會影響酶的空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶活力。隨著交聯(lián)pH值的增加，固定化乳糖酶的活力逐漸增大；當(dāng)pH值為7時，固定化乳糖酶活力達(dá)到最高；當(dāng)pH值為8時，固定化乳糖酶活力又有所下降。因此，選擇pH值為7作為交聯(lián)pH值。

2.7 固定化溫度確定

固定化溫度對固定化酶活力的影響見圖7。

圖7 固定化溫度對固定化酶活力的影響

由圖7可知，固定化溫度對固定化乳糖酶活力的影響較大。4℃固定時，固定化乳糖酶活力最高；當(dāng)固定化溫度由20℃升高到40℃時，固定化乳糖酶活力隨著固定化溫度的升高而迅速下降。因此，選擇4℃作為乳糖酶的固定化溫度。

2.8 固定化時間確定

固定化時間對固定化酶活力的影響見圖8。

圖8 固定化時間對固定化酶活力的影響

由圖8可知，當(dāng)固定化時間少于9 h時，固定化乳糖酶活力隨著固定化時間的延長而升高；當(dāng)固定化時間達(dá)到9 h時，固定化乳糖酶活力達(dá)到最大；當(dāng)固定化時間大于9 h，固定化乳糖酶活力迅速下降，這可能是由于固定化時間延長，固定在載體上的乳糖酶量越多，造成載體上結(jié)合酶的空間位阻，使固定化乳糖酶活力下降。因此，選擇9 h作為乳糖酶固定化時間。

2.9 乳糖酶用量確定

乳糖酶用量對固定化效果的影響見圖9。

圖9 乳糖酶用量對固定化效果的影響

由圖9可知，當(dāng)乳糖酶用量為2.0 mL時，固定化乳糖酶活力達(dá)到最高；當(dāng)酶用量多于2.0 mL時，固定化乳糖酶活力迅速降低?？梢姡壳蛐螝ぞ厶瞧浠钚曰鶊F是一定的，在結(jié)合位點未飽和前，固定化乳糖酶活性隨著用量的增加而升高，當(dāng)結(jié)合位點飽和后，增加乳糖酶用量不能提高固定化酶活力，反而使其固定化乳糖酶活力下降。試驗表明，當(dāng)乳糖酶用量為2.0 mL時，固定化乳糖酶活力最高，此時酶活力回收率為1.94%。

2.10 最優(yōu)條件下固定化乳糖酶活力

將1.0 g殼聚糖載體（前面是0.2 g載體） 先用0.4%戊二醛溶液7.5 mL，于30℃條件下交聯(lián)16 h；再用1.0%乳糖酶溶液10.0 mL，于4℃條件下固定9 h，此條件下制得的固定化乳糖酶活力為0.735 U/g，酶活力回收率為2.45%。

3 結(jié)論

研究表明，用先交聯(lián)后固定的固定化方法可將乳糖酶很好地固定在殼聚糖載體上，即先用戊二醛交聯(lián)使殼聚糖載體活化，后將殼聚糖載體與乳糖酶進行固定制備固定化乳糖酶。將1.0 g殼聚糖載體先用0.4%戊二醛溶液7.5 mL，于30℃條件下交聯(lián)16 h；再用10 mL 1.0%乳糖酶溶液于4℃條件下固定9 h，此條件下制得的固定化乳糖酶活力為0.735 U/g。

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