響應面法優化煙梗中煙堿提取

張志平，李元清，劉建國，宋麗麗

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院煙草行業煙草工業生物技術重點實驗室，河南鄭州 450001；2.浙江中煙工業有限責任公司技術中心，浙江杭州 310024）

0 引言

煙梗是煙葉的重要組成部分，經過梗葉分離后可制得占煙葉質量25%～30%的煙梗，我國每年可生產約70×104t煙梗[1]。目前，煙梗主要被用于制造在卷煙中添加的煙用梗絲和再造煙葉[2]，但由于煙梗自身的特點，在卷煙中使用率并不高，仍有1/3被廢棄[3]。煙梗與煙葉中的化學成分基本相同，但含量差異顯著[4]，其中煙堿是煙梗中含有的一種生物堿，為二元弱堿，多與檸檬酸或蘋果酸形成化合物存在于煙草和煙梗中[5]。煙堿在醫藥[6-8]、農業[7-9]、化工、煙草工業等領域有較大的應用價值，目前市場中的煙堿產品主要有純度為40%的硫酸煙堿和95%以上的純煙堿[10]。國內外對煙堿的提取工藝與應用有較多研究，大部分報道均是采用煙葉作為提取原料[11-12]，而有關煙梗中煙堿的提取工藝鮮有報道。

目前，從煙草中提取煙堿的方法有離子交換法、水蒸氣蒸餾法、萃取法等[13]。為了優化煙梗中煙堿的提取工藝，以煙堿提取量為考查指標，以水為提取溶劑，通過水浴時間、水浴溫度、溶劑pH值、提取次數、料液比等單因素試驗，進一步采用PB試驗對試驗因素進行篩選，在最陡爬坡試驗的基礎上，完成中心組合試驗（CCD），確定水提取煙梗中煙堿的最佳提取工藝，為煙梗中煙堿的提取提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙梗，來自福建地區，為2016年長梗；煙堿標準品（Sigma公司，純度＞99%）；NaOH（AR）、甲醇（SR）、超純水、磷酸氫二鈉（AR）、磷酸（AR）等。

BS201S型分析天平、BCD-275MBC型冰箱、ST-07B型粉碎機、離心機、鼓風干燥機、PHS-3C型pH計、Agilent7820A型高效液相色譜儀、DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預處理

將煙梗去除雜質，放入干燥箱中于105℃條件下干燥至恒質量。

1.2.2 煙堿的提取

準確稱取干燥至恒質量的煙梗5 g于250 mL的三角瓶中，加入提取溶劑水，在一定條件下進行水浴提取，然后常規濾紙過濾、定容，取2 mL濾液，以轉速12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL經0.45 μm水系濾膜過濾，然后進行高效液相色譜測定。

1.2.3 煙堿的測定

（1） 標準曲線的繪制。以煙堿標準品為對照，采用高效液相色譜法測定煙堿，色譜條件為色譜柱：Symmetry C18（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相為V1（甲醇）：V2（0.02 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液pH值6.0） =70∶30；檢測波長259 nm；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30℃。煙堿質量濃度X與色譜峰面積Y建立回歸方程為：Y=13 162X（R2=0.999 6）。

（2）樣品中煙堿提取量的測定。取1.2.2中過水系濾膜后的濾液進行液相色譜測定，記錄峰面積，根據標準曲線求出濾液中煙堿的質量濃度C，進而求出煙堿的提取量。煙堿的提取量按公式（1）計算。

式中：C——提取液中煙堿的質量濃度，mg/mL；

V——提取液的體積，mL；

m——樣品的質量，g。

1.2.4 煙堿提取條件的初步確定

采用單因素試驗研究溶劑pH值、水浴溫度、水浴時間、料液比對煙堿提取量的影響。按照1.2.2中的提取步驟，分別進行試驗測定。

1.2.5 響應面優化煙梗中煙堿的提取條件

（1） 全因子試驗設計（DOE）[14]。在單因素試驗的基礎上進行全因子試驗設計，對溶劑pH值、水浴溫度、水浴時間、料液比4個因素，以煙堿提取量為響應值進行二水平的試驗，篩選對提取率有顯著影響的因素。

全因子試驗的因素與水平設計見表1。

表1 全因子試驗的因素與水平設計

（2）最陡爬坡試驗[15]。根據全因子試驗的結果，選擇顯著因素，根據方程的回歸系數的符號和大小，設計關于顯著因素的最陡爬坡方向與步長，有效逼近最大理想區域。

（3） 中心組合設計[16]。以全因子試驗確定的顯著因素，結合最陡爬坡確定的最佳試驗組合，以該組合為中心點進行響應面分析。

中心組合設計的因素與水平設計見表2。

表2 中心組合設計的因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溶劑pH值對煙堿提取量的影響

單因素試驗結果見圖1。

煙堿的提取量在酸性和堿性條件下均具有較高的提取量，在酸性條件下，煙堿以煙堿鹽的形式存在，酸性越強，溶解在水中的煙堿鹽越多，在堿性條件下，煙堿鹽可解離為游離煙堿，增大溶液的堿性，有利于煙堿鹽解離成游離煙堿[4]。由圖1（a） 可知，在堿性條件下，隨著溶劑pH值的增大而提高，當溶劑pH值超過11后，煙堿的提取量趨于平衡。最佳溶劑pH值為11時煙堿的最大提取量為4.012 mg/g。

2.1.2 水浴溫度對煙堿提取量的影響

由圖1（b）可知，煙堿提取量隨著水浴溫度的升高而提高，當水浴溫度超過50℃后煙堿的提取量反而下降，因為溫度超過一定值后，煙堿和水溶液的互溶效果降低，導致提取量的下降，因此最佳水浴溫度為50℃時煙堿的最大提取量為4.101 mg/g。

2.1.3 水浴時間對煙堿提取量的影響

由圖1（c） 可知，煙堿的提取量隨水浴時間的增加而提高，在1 h后煙堿的提取量趨于平衡，根據固液傳質理論，在提取初期，也就是在0～1 h擴散作用居主導地位，固液傳質中存在濃度平衡，在1 h之后，煙堿的提取量趨于平衡，因此，最佳水浴時間為1 h時煙堿的最大提取量為4.101 mg/g。時間（C）、料液比4個因素對煙堿提取量的影響，以煙堿提取量為響應值。

圖1 單因素試驗結果

全因子試驗設計結果見表3。

表3 全因子試驗設計結果

根據表3中的結果進行回歸模型方差分析，得到的回歸方程為Y=3.816 8-0.056 7A+0.200 6B+0.167 1C+0.144 1D，其中，p<0.001，R2=0.916 4，因此該模型擬合效果較好。

全因子試驗設計的主效應分析見表4。

表4 全因子試驗設計的主效應分析

2.1.4 料液比對煙堿提取量的影響

由圖1（d）可知，料液比對煙堿提取量有較大的影響，隨著料液比的增加，煙堿提取量也逐漸增大。推測原因：隨著料液比加大，料液之間的濃度差也逐漸加大，導致煙堿向溶劑中轉移。料液比超過1∶25后，煙堿提取量趨于平緩，考慮節約溶劑的因素，選擇最佳料液比為1∶25，煙堿提取量為4.348 mg/g。

2.2 響應面優化煙梗中煙堿的提取工藝

2.2.1 全因子試驗（DOE） 設計結果

依據單因素試驗結果，進行全因子試驗（DOE）設計，考查溶劑pH值（A）、水浴溫度（B）、水浴

由表4可以得到，對煙堿提取量影響顯著的因素分析為水浴溫度、水浴時間和料液比。

2.2.2 最陡爬坡試驗設計

根據2.2.1得到的回歸方程和表3的分析結果設計最陡爬坡的方向和步長，水浴溫度、水浴時間、料液比對煙堿提取量的影響顯著，而且三者的系數均為正，說明增加三者的水平可以增加煙堿的提取量，以單因素試驗的中心點為出發點，設計最陡爬坡試驗。

煙堿提取的最陡爬坡試驗設計及結果見表5。

2.2.3 中心旋轉組合（CCD）試驗設計及結果

以最陡爬坡試驗的最優值所對應的組合為中心點，進行中心旋轉組合設計，共20個試驗點。

中心組合試驗設計（CCD）結果見表6。

利用Minitab對表中數據做回歸分析和擬合優化，得到響應面回歸模型為：

表5 煙堿提取的最陡爬坡試驗設計及結果

表6 中心組合試驗設計（CCD）結果

式中：Y——煙堿提取量。

中心組合試驗設計（CCD）方差分析見表7。

由表7可知，模型的F值為8.77，p<0.001，模型極顯著，失擬項p值為0.252，失擬項不顯著，其R2為0.887 6，響應值的變化有88.76%來源于所選因素，表明方程擬合度較好，因此模型具有實際應用意義。

從表7中可以看出，B，C，D，B2，D2對Y值有顯著影響，可見試驗因素對煙堿提取量的影響不是簡單的線性關系，各因素對煙堿提取量的影響大小順序為料液比＞水浴溫度＞水浴時間。

2.2.4 響應曲面擬合和最佳試驗點的確定

為了更直觀地觀察各因素和各因素間的交互作用，利用Minitab軟件做出回歸方程中交互項的響應曲面圖與等值線圖。

水浴溫度和水浴時間對煙堿提取量的影響見圖2，水浴溫度與料液比對煙堿提取量的影響見圖3，水浴時間與料液比對煙堿提取量的影響見圖4。

表7 中心組合試驗設計（CCD）方差分析

圖2 水浴溫度和水浴時間對煙堿提取量的影響

由圖2可知，在料液比不變的前提下，水浴時間一定，隨水浴溫度的提高，煙堿提取量迅速增大，然后迅速減小；水浴溫度一定，隨著水浴時間的延長，煙堿的提取量先增加后緩慢降低，說明水浴時間對煙堿提取量的影響比水浴溫度大。由圖3可知，在水浴時間不變的前提下，水浴溫度一定，隨著料液比的增大，煙堿的提取量先增加后緩慢降低；料液比一定，隨著水浴溫度的升高，煙堿的提取量先增加后迅速降低，說明料液比對煙堿提取量的影響比水浴溫度大。由圖4可知，在水浴溫度不變的前提下，料液比一定，隨著水浴時間的延長，煙堿的提取量先增加后降低；水浴時間一定，隨著料液比的增大，煙堿的提取量先增加后緩慢降低，說明料液比對煙堿提取量的影響比水浴時間大。3個因素對煙堿提取量影響的先后順序為料液比、水浴時間和水浴溫度。

圖3 水浴溫度與料液比對煙堿提取量的影響

圖4 水浴時間與料液比對煙堿提取量的影響

通過中心旋轉組合設計對試驗進行結果優化，利用Minitab軟件求解響應面方程最大值，結果見圖5，得出最佳提取工藝為水浴溫度52.3℃，水浴時間69.01 min，料液比1∶29.8（g∶mL），溶劑pH值為11。在此條件下得到煙堿的提取量預測值為4.591 1 mg/g。

響應面方程最優組合見圖5。

圖5 響應面方程最優組合

2.3 驗證試驗

為檢驗響應面所得結果的可靠性，采用上述得到的最佳提取工藝組合進行煙梗煙堿成分的提取。考慮到試驗的進行，將最佳工藝條件修改為水浴溫度 52℃，水浴時間 70 min，料液比 1∶30（g∶mL），pH值11，在此條件下對煙梗中的煙堿進行提取，煙堿的提取量為4.522±0.051 mg/g，與預測值相差僅為1.5%，預測值可靠，說明試驗結果與模型符合良好，基于響應面法分析所得的優化提取工藝參數準確可靠，具有實際參考價值。

3 結論

以煙梗為原料，通過單因素試驗，系統研究溶劑pH值、水浴時間、水浴溫度和料液比對煙梗煙堿提取量的影響。利用Minitab進行全因子試驗設計（DOE）、最陡爬坡試驗和中心旋轉組合設計（CCD），得出水溶劑提取煙梗中煙堿成分的最佳提取工藝為水浴溫度52℃，水浴時間70 min，料液比1∶30（g∶mL），溶劑pH值11，在此條件下，煙堿提取量為4.522±0.051 mg/g，與預測值基本相符，因此經響應面優化后的提取條件是可行的。試驗為煙梗資源化利用提供了一條途徑。

[1]李曉，紀曉楠，姚二民，等.煙用梗絲加工工藝研究進展 [J]．貴州農業科學，2013，41（8）：182-186．

[2]于建軍．卷煙工藝學 [M]．北京：中國農業出版社，2009：75-80．

[3]張永良，周曉微，梁萌．煙梗綜合利用研究進展 [J]．現代農業科技，2016（8）：232-234．

[4]韓富根．煙草化學 [M]．第2版．北京：中國農業出版社，2010：33-40．

[5]馬俊勃．煙堿提取的研究進展 [J]．廣東化工，2011，38（10）：72-73．

[6]White H E.Four-week nicotine skin patch treatment effects on cognitive performance in Alzheimer's disease[J].Psychopharmacology，1999 （7）：158-165.

[7]Levin E J.Nicotine-haloperidol interactions and cognitive performance in schizophrenia[J].Neuropsychopharmacology，1996，15 （5）：429-436.

[8]Masato S，Mari S，Hirofumi M.Nicotinic regulation of experience-dependent plasticity in visual cortex[J].Journal of Physiology，Paris，2016 （1/2）：29-36.

[9]劉智.淺析煙堿類殺蟲劑及其市場走勢 [J].農藥市場信息，2017（22）：34-34.

[10]袁菊如，徐國良.煙堿提取方法探討 [J].江西化工，2013 （2）：12-14.

[11]吳映捷，呂新美，閆兵兵，等.響應面法優化酶輔助提取廢棄煙葉中煙堿 [J].山東農業大學學報（自然科學版），2017（2）：203-209.

[12]米爾扎提·麥麥提，爾西丁·買買提，喀日耶姆·艾海提，等.正交試驗優化逆三相膜萃取煙堿的工藝研究 [J].新疆醫科大學學報，2016（11）：1 436-1 439.

[13]張先海，史麗巖，史景明.煙堿的研究現狀 [J].海峽藥學，2010，22（11）：16-18.

[14]Deka D，Bhargavi P，Sharma A，et al.Enhancement of cellulase activity from a new strain of bacillus subtilis by medium optimization and analysis with various cellulosic substrates[J].Enzyme Research，2011（5）：151 656-151 662.

[15]顧華杰，孫燕，李良智，等.響應面法優化熱水浸提灰樹花多糖的工藝研究 [J].食品工業科技，2013（19）：234-238，243.

[16]張霞忠，王丹，董垠紅，等.中心組合設計優化超聲提取檸檬籽中的檸檬苦素 [J].中成藥，2016（7）：1 500-1 504.◇