11β-HSD1抑制劑對(duì)大鼠股骨頭壞死微環(huán)境及骨重建影響的實(shí)驗(yàn)研究

何 寧，曾 云，王志勇，韓 珩，唐 冰，熊 敏

0 引言

骨代謝過(guò)程中起決定作用的細(xì)胞是成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞，可促進(jìn)骨形成和骨吸收，糖皮質(zhì)激素在維持骨吸收、骨形成的平衡以及在促進(jìn)骨代謝、骨骼生長(zhǎng)等方面發(fā)揮了必不可少的作用[1-3]。然而，目前，隨著糖皮質(zhì)激素類藥物的廣泛使用，由激素所引發(fā)的股骨頭壞死比較常見(jiàn)，后者可引起骨組織產(chǎn)生一系列的病理性變化，影響骨功能[4]。內(nèi)源糖皮質(zhì)激素的關(guān)鍵代謝酶是11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD1)，也是糖皮質(zhì)激素在組織水平上的前受體調(diào)節(jié)劑，可以催化C11 位的酮基轉(zhuǎn)化為羥基，使皮質(zhì)醇向11-脫皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化，生物學(xué)活性喪失[5-7]。有研究表明，在特殊狀態(tài)下，局部11β-HSD1可能改變，引起糖皮質(zhì)激素水平變化，骨代謝穩(wěn)態(tài)受到影響[8-11]。本文探討了11β-HSD1抑制劑對(duì)大鼠股骨頭壞死微環(huán)境及骨重建的影響，分析11β-HSD1的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供的清潔級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20) g，合格證號(hào)：SYXK2103-0003。懸吊動(dòng)物飼養(yǎng)飲水瓶，使動(dòng)物飲水時(shí)，下肢保持直立，喂養(yǎng)采用普通飼料。鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)購(gòu)自武漢博士德公司；醋酸皮質(zhì)酮購(gòu)自Sigma公司；一抗11β-HSD1購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 動(dòng)物處理 采用抽簽法隨機(jī)分組，清潔級(jí)SD大鼠40只分為空白組10只和模型組30只，每次實(shí)驗(yàn)均精確稱重，模型組建立激素誘導(dǎo)股骨頭壞死模型。本研究參照文獻(xiàn)[4]的造模法，模型組建立激素誘導(dǎo)股骨頭壞死模型，于腹腔注射青霉素鈉(14萬(wàn)U/只)和醋酸潑尼松龍(24.5 mg/kg)，2次/周，連續(xù)使用4周?？瞻捉M用生理鹽水代替激素，于腹腔內(nèi)注射等劑量的青霉素和生理鹽水。模型組造模成功后分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，各15只，對(duì)照組不進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)組選擇腹腔內(nèi)注射11β-HSD1抑制劑(8 g/kg)，2次/周，處理4周。

1.3 觀察指標(biāo) ①11β-HSD1檢測(cè)：頸椎脫臼法處死大鼠，無(wú)菌條件下摘取其雙側(cè)股骨頭，制作標(biāo)本，進(jìn)行石蠟切片，采用兔抗大鼠多克隆一抗11β-HSD1，測(cè)定11β-HSD1在股骨頭內(nèi)的表達(dá)，選擇β-actin作為內(nèi)標(biāo)，4 ℃冰箱孵育12 h，采用免疫印跡法。②TGF-β1檢測(cè)：抽取實(shí)驗(yàn)大鼠的腹部靜脈血，4 ℃ 2 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清TGF-β1含量。③SOD與MDA檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)后將10%水合氯醛350 mg/kg注射于腹腔，將大鼠頸椎脫臼法處死后，進(jìn)行SOD與MDA的檢測(cè)，檢測(cè)區(qū)域?yàn)槟X組織海馬區(qū)。

2 結(jié)果

2.1 11β-HSD1表達(dá)情況對(duì)比 模型組的11β-HSD1相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組的11β-HSD1相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同大鼠的11β-HSD1表達(dá)情況比較

2.2 血清TGF-β1含量對(duì)比 模型組的血清 TGF-β1含量為(51.44±6.39) pg/mL，空白組為(29.44±4.29) pg/mL，試驗(yàn)組為(48.29±5.11) pg/mL，對(duì)照組為(59.22±5.11) pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 各組大鼠11β-HSD1表達(dá)情況對(duì)比

表2 不同大鼠的血清 TGF-β1含量表達(dá)情況比較

2.3 SOD與MDA含量對(duì)比 與空白組相比，模型組SOD含量減少(P<0.05)，MDA顯著增加(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組的SOD與MDA含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同大鼠的腦組織SOD、MDA含量比較

3 討論

骨重建過(guò)程是一個(gè)新骨替換舊骨的過(guò)程，伴隨著骨吸收與骨形成過(guò)程相偶聯(lián)。骨形成過(guò)程中，成骨細(xì)胞在骨基質(zhì)的礦化、合成及分泌中起主要作用，為主要的功能細(xì)胞[12]；對(duì)糖皮質(zhì)激素較為敏感[13]，正常劑量下功能維持，高劑量下不耐受，會(huì)引發(fā)骨小梁密度減少等情況的發(fā)生，延緩骨重建進(jìn)程，誘導(dǎo)股骨頭壞死的發(fā)生[14]。股骨頭微環(huán)境內(nèi)存在多種細(xì)胞成分，包括成骨細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。

現(xiàn)代研究表明，骨組織內(nèi)的11β-HSD1與糖皮質(zhì)激素所引發(fā)的骨代謝異常緊密相關(guān)。11β-HSD1屬于短肽鏈乙醇氧化還原酶家族，定位于1號(hào)染色體上，含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，6個(gè)外顯子。糖基化抑制劑對(duì)11β-HSD1的脫氫酶起到抑制作用[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松誘導(dǎo)人前成骨細(xì)胞株，11β-HSD1的活動(dòng)隨地塞米松劑量加大而逐漸下降，在IL-1β、TNF-α等炎癥因子協(xié)同下，可導(dǎo)致11β-HSD1的表達(dá)增多，骨代謝異常及股骨頭壞死發(fā)生的可能性增加[16]；細(xì)胞堿性磷酸酶的礦化活動(dòng)隨地塞米松劑量加大而逐漸增多，具有平臺(tái)期[17]。本研究顯示，模型組的11β-HSD1相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組，實(shí)驗(yàn)組的11β-HSD1相對(duì)表達(dá)量低于于對(duì)照組。也有研究顯示，健康男性的外周血骨鈣蛋白、N-末端Ⅰ型膠原前肽等骨形成標(biāo)志物，在攝入過(guò)量的潑尼松后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，下降程度與體內(nèi)11β-HSD1活動(dòng)相關(guān)[18]。骨重建過(guò)程與成骨細(xì)胞分化的功能狀態(tài)、不同的階段、細(xì)胞數(shù)量等具有相關(guān)性。

11β-HSD1在成骨與脂肪細(xì)胞均有中等量表達(dá)，能影響細(xì)胞局部?jī)?nèi)源性糖皮質(zhì)激素的二次激活。而在股骨頭微環(huán)境中，隨著成骨及脂肪細(xì)胞外部?jī)?nèi)源性糖皮質(zhì)激素水平的下降，11β-HSD1的表達(dá)反而增強(qiáng)[19]。有報(bào)道，當(dāng)糖皮質(zhì)激素過(guò)量，11β-HSD1與糖皮質(zhì)激素的關(guān)系呈現(xiàn)正相關(guān)，延長(zhǎng)皮質(zhì)醇的活性半衰期，增強(qiáng)激素對(duì)組織或成骨細(xì)胞的效應(yīng)，影響微環(huán)境內(nèi)骨小梁發(fā)育及生理狀態(tài)[20]。TGF-β1在血小板和骨組織中含量豐富，是一種具有多種功能的多肽，可以促血管生長(zhǎng)，與各類軟組織的損傷修復(fù)相關(guān)，起促進(jìn)作用。TGF-β1在骨與軟骨的形成、炎癥反應(yīng)以及組織修復(fù)過(guò)程中也起到重要作用。本研究顯示，11β-HSD1抑制劑對(duì)11β-HSD1表達(dá)的調(diào)節(jié)，有利于激素性股骨頭缺血壞死大鼠股骨頭的重建。也有研究表明，隨著人類年齡增長(zhǎng)，IGF-1β等生長(zhǎng)因子含量減少，而11β-HSD1在骨組織中的表達(dá)增加，導(dǎo)致骨組織含水量減少，骨的彈性減弱，抗壓能力降低[21]。

正常機(jī)體氧自由基產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，但是由于多因素的影響，機(jī)體氧自由基平衡失調(diào)，生成增加，而清除減少，過(guò)多的活性氧對(duì)DNA、酶類以及生物膜類等產(chǎn)生破壞作用，引發(fā)細(xì)胞死亡，損傷腦組織，產(chǎn)生破壞作用[22]。脂質(zhì)過(guò)氧化的主要終產(chǎn)物是MDA，機(jī)體內(nèi)MDA水平可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度以及氧自由基水平。SOD經(jīng)歧化反應(yīng)，使氧自由基減少，從而使細(xì)胞損害減少。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組SOD含量減少，MDA含量顯著增加；實(shí)驗(yàn)組的SOD與MDA含量與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明11β-HSD1抑制劑清理自由基和抗氧化作用更強(qiáng)。有研究表明，11β-HSD1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)激素處理后，其成骨細(xì)胞、骨形成率、骨質(zhì)面積與經(jīng)激素處理的普通實(shí)驗(yàn)大鼠相比，明顯增高，說(shuō)明早期前分化細(xì)胞的排列及成熟過(guò)程受11β-HSD1影響，表達(dá)過(guò)多會(huì)出現(xiàn)一定的干擾[23]。

總之，11β-HSD1抑制劑能夠改善大鼠股骨頭壞死的微環(huán)境，抑制TGF-β1的表達(dá)，增強(qiáng)成骨作用，有利于骨重建。

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